覃晓虹 刘志昂 陆婷婷 杨 溢 董建辉

(中国人民解放军联勤保障部队第九二三医院1 检验科，2 移植科，广西南宁市 530021，电子邮箱：499432680@qq.com)

研究表明，器官移植后容易出现排斥反应，而这是影响移植物能否在受者体内存活及存活时间长短的最主要因素[1]。因此，移植排斥反应的早期诊断也越来越受到重视。微小RNA(microRNA，miRNA)为内源性非编码RNA，其在免疫调节、胚胎发育、肿瘤发生和进展等方面发挥重要作用[2-3]。最近有研究显示，血清miRNA-21表达水平与肾细胞的增殖及凋亡有关[4]。但目前关于肾移植术后患者血清miRNA-21水平与移植肾早期急性排斥反应的关系的研究较少。因此，本研究探讨肾移植术后患者血清miRNA-21表达水平变化及其与早期急性排斥反应的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2019年4月至2020年3月我院收治的78例肾移植术后患者作为研究对象。纳入标准：均为首次行同种异体肾移植术且供受者血型相配，淋巴细胞毒试验呈阴性，群体反应性抗体<10%。排除标准：发生严重手术并发症者、多器官联合移植者、重症感染者及其他类型肾病者。根据肾移植术后1个月内是否发生急性排斥反应，将其分为急性排斥组33例和非急性排斥组45例。急性排斥反应的诊断：通过移植肾穿刺病理检查结果、影像学检查结果、实验室检测指标及患者临床症状等综合分析做出判断[5]。急性排斥组中男性19例、女性14例，年龄23～58(36.59±6.07)岁；非急性排斥组中男性27例、女性18例，年龄21～60(35.31±5.59)岁。两组患者在性别、年龄差异均无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。本研究通过医院伦理学委员会审批。

1.2 方法

1.2.1 样本收集：分别于术前及术后1周采集两组患者晨起空腹静脉血5 mL， 2 500 r/min离心15 min分离血清，置于-80℃保存待检。

1.2.2 检测方法：(1)参照TRIzol试剂盒(Life Technologies公司，产品批号：181103)说明书操作提取血清总RNA后，检测样本中RNA浓度及纯度。(2)参照反转录试剂盒(Life Technologies公司，产品批号：190224)说明书进行反转录，反应体系为20 μL，包括2 μL RNA样品、1 μL引物、1 μL反转录酶、1 μL内参引物、0.5 μL RNase 抑制剂 、1 μL dNTP混合物(10 mmol/L)、4 μL 5×RT 缓冲液、9.5 μL不含RNase的 H2O 。反应条件为42℃ 30 s，92℃ 10 min，65℃ 30 s，32℃ 1 min，产物置于-20℃保存。(3)采用实时荧光定量PCR仪(厂家：Life Technologies公司，型号：7900HT)进行PCR扩增，反应体系为25 μL，包括2 μL稀释的cDNA、12.5 μL SYBP Premix EX TaqTMⅡ、2 μL引物、8.5 μL ddH2O 。反应条件：30℃ 5 min，42℃ 10 min，85℃ 30 s，45℃ 1 min，40个循环。miRNA-21及内参U6引物由上海生工生物工程公司合成。miRNA-21上游引物序列为5′-AGCAAGUCUGAGUACUGAUGCAGUGCAUCAUGUCACCGUUGCAU-3′，下游引物序列为5′-ACAAAUCGACUUGCAUCGCCUGU-3′；内参U6引物序列为5′-TCTCGCTCGCACGCAGA-3′(正向)，5′-TAACGCTCACAATTTGCGGT-3′(反向)；miRNA-21反转录引物序列为5′-CUCGUGAUUUACUGGCCCCUGCUCGAGAGAUGAGGAUAACUAGCACUGAGCCA-3′；内参U6反转录引物序列为5′-CTTGCGCGGAATAGCTTCTTCAT-3′。miRNA-21的相对表达水平= 2-ΔΔCt值(miRNA-21)- 2-ΔΔCt值(U6)[6]计算。

2 结 果

2.1 两组患者手术前后血清miRNA-21相对表达水平的比较 两组患者术前血清miRNA-21相对表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；术后1周，两组患者的血清miRNA-21相对表达水平均高于术前，且急性排斥组血清miRNA-21相对表达水平高于非急性排斥组(均P<0.05)，见表1。

表1 两组患者手术前后血清miRNA-21相对表达水平的比较(±s)

2.2 血清miRNA-21对移植肾早期急性排斥反应的预测价值 以术后血清miRNA-21相对表达水平作为检验变量，以移植肾是否出现急性排斥反应为状态变量作ROC曲线。结果显示，血清miRNA-21预测移植肾早期急性排斥反应的曲线下面积为0.715(95%CI：0.794，1.608；P=0.009)，约登指数为0.692，最佳临界值为2.04，特异度为81.93%，灵敏度度为93.65%，见图1。

图1 血清miRNA-21预测移植肾早期急性排斥反应的ROC曲线

2.3 Kaplan-Meier生存分析 根据肾移植受者术后1周血清miRNA-21相对表达水平，将患者分为miRNA-21高表达组(>2.19)27例和miRNA-21低表达组(≤2.19)51例。miRNA-21高表达组肾移植术后30 d内无急性排斥反应生存率为48.15%，低于miRNA-21低表达组的72.55%(χ2=4.568，P=0.033)，见图2。

图2 Kaplan-Meier生存曲线

3 讨 论

肾移植是大多数终末期肾脏疾病患者的理想治疗方式，但术后移植肾可能会发生排斥反应，包括急性排斥反应和慢性排斥反应，其中急性排斥反应可对移植肾的长期存活造成一定影响[7-8]。因此，临床上应重视移植肾急性排斥反应的早期诊断，并给予及时、有效的治疗，以延长移植肾的存活时间。miRNA是一类具有高时序性、保守性、组织特异性等特征的内源性非编码RNA，既往研究显示，miRNA-199a-9p、miRNA-663等与急性排斥反应的发生存在一定关系[9-10]。miRNA-21位于17q23.2染色体上，其在肿瘤、肾脏疾病、心血管疾病等中发挥重要作用[11]。有研究显示，肾移植术后患者血清miRNA-21的表达水平与其肾功能密切相关[12]。因此，本研究探讨肾移植术后患者血清miRNA-21的表达水平及其与移植肾早期急性排斥反应的相关性。

晋力等[13]研究发现，miRNA-1426p、miRNA-144-5p、miRNA-130a-3p在肾移植术后急性排斥反应患者血浆中呈高表达。王本刚等[14]的研究表明，miRNA-27a和长链非编码RNA LRFN2-2基因与肾移植后排斥反应的发生有关。由以上研究可知，miRNA与肾移植术后急性排斥反应密切相关。本研究结果显示，术后1周，两组患者的血清miRNA-21相对表达水平均高于术前，且急性排斥组患者的血清miRNA-21相对表达水平高于非急性排斥组(均P<0.05)；进一步采用Kaplan-Meier进行生存分析，发现miRNA-21高表达组的肾移植术后30 d内无急性排斥反应生存率低于miRNA-21低表达组(均P<0.05)。以上结果提示在移植肾急性排斥反应早期血清miRNA-21表达上调，且肾移植术后患者血清miRNA-21的水平变化与移植肾早期的急性排斥反应密切相关。

刘小友等[15]研究发现，miRNA-663在肾移植急性排斥反应中发挥调控作用，可作为早期诊断移植肾急性排斥反应的评价指标。Iwasaki等[16]研究发现， miRNA-142-5p和miRNA-486-5p可作为肾移植排斥反应的早期诊断标记物，两者联合诊断的特异度和灵敏度均较高。本研究结果显示，术后血清miRNA-21预测移植肾早期急性排斥反应的曲线下面积为0.715，最佳临界值为2.04，特异度为81.93%，灵敏度度为93.65%，提示miRNA-21对预测移植肾早期急性排斥反应具有重要价值。Khalid 等[12]研究发现，miRNA-21的异常表达可能提示肾移植患者预后不良。因此，我们推测术后血清miRNA-21或可作为预测移植肾早期急性排斥反应的生物学标记物。

综上所述，在移植肾急性排斥反应早期患者血清miRNA-21表达上调，其或可成为预测移植肾早期急性排斥反应的生物学标记物。由于本研究样本量有限，研究结果存在一定局限性，今后会增加样本量，深入探讨miRNA-21在移植肾急性排斥反应中的作用机制。