桂花果实HPLC指纹图谱及9种化学成分含量测定研究

2021-08-05谢明珠祝廷辉唐伟卓

中草药 2021年15期

李爽，陈艳，谢明珠，杨涛，祝廷辉，唐伟卓

长沙学院生物与环境工程学院，湖南长沙 410022

桂花Osmanthus fragransL.又名木犀，为我国的十大传统名花之一，主产四川、广西、湖南、江苏、湖北等地。《本草纲目》载：“桂花生津、辟臭、化痰，治风火牙痛”，其根、花、果实均可入药[1-2]。桂花具有较高的观赏价值和园林用途，种植和分布广泛，在我国已有2500 多年的栽培历史，形成了丰富的桂花种质资源[3]。桂花果实又称为桂花子，长卵形，状如小橄榄，成熟时呈紫黑色。《江苏药材志》和《植物名实图考长编》载“桂花子，味甘、辛，性温，能暖胃、益胃，散寒”，民间用作止痛剂，治疗肝胃气病和心痹疼痛[4]。

通过文献查询，桂花的相关研究主要集中在其花和叶部位，内容涵盖花部位芳香性成分的分析和提取[4-8]、多糖提取[9]、黄酮成分[10]及叶部位的挥发油分析[11-14]等方面，而有关桂花果实的研究相对偏少，已有文献报道了桂花果实色素[15-16]及粗提物的活性研究[17-19]。整体上，涉及桂花果实系统的化学成分分析报道有限。我国作为桂花的主要产区，拥有大量的桂花果实资源。但是，桂花果实除了少数作为种质资源进行育苗和栽培外，大多数作为农业废弃物处理，没有得到充分利用，造成了一定的浪费。课题组前期对桂花果实的油脂性成分进行了脂肪酸分析[20-21]，同时对其中环烯醚萜苷类成分的提取工艺及生物活性也进行了初步探讨[22]。上述工作提示桂花果实具有较好的开发价值和潜力。

为了更好地开发桂花果实这种药用资源，本实验对桂花果实进行HPLC 指纹图谱研究，建立其中红景天苷、毛蕊花糖苷、新女贞苷、特女贞苷、异麦角甾苷、女贞苷G13、槲皮素、芹菜素和山柰酚9 种化学成分的同步测定方法，同时，开展不同产地桂花果实的含量比较分析，以期为桂花果实质量控制和综合利用提供参考。

1 仪器与材料

Waters e2695 高效液相色谱仪及2998 PDA 检测器，美国Waters 公司；TMT-3 电子天平，湖南湘仪天平仪器设备有限公司；MS105/A 分析天平，美国Metler Toledo 公司；KQ-400DE 型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司；DFT-100 中药粉碎机，温岭市林大机械有限公司。

红景天苷（批号B20504，质量分数≥98%）、毛蕊花糖苷（批号B20715，质量分数≥98%）、新女贞苷（批号B25825，质量分数≥95%）、异麦角甾苷（批号B21535，质量分数≥98%）、槲皮素（批号B20527，质量分数≥98%）、芹菜素（批号B20981，质量分数≥98%）、山柰酚（批号B21126，质量分数≥98%）、特女贞苷（批号B21240，质量分数≥98%）、女贞苷G13（批号B20924，质量分数≥98%）对照品购自上海源叶生物；色谱级乙腈购自Tedia公司；纯净水，屈臣氏集团，其余分析级试剂均购自于国药集团化学试剂有限公司。不同产地桂花果实2019年5月分别购自于当地市场，经长沙学院陈建荣教授鉴定为木犀属植物桂花O.fragranceL.的干燥成熟种子，各种标本现保存于长沙学院生物与环境工程学院天然产物研究中心。具体信息见表1。

表1 样品信息Table 1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为YMC-Pack ODS-A（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）～0.1%磷酸水溶液（B）；梯度洗脱：0～35 min，10%～30% A；35～50 min，30%～50% A；50～51 min，50%～95% A；51～60 min，90% A；60～61 min，95%～10% A；61～65 min，10% A；体积流量1.0 mL/min，进样体积10 μL，波长210 nm，柱温25 ℃。

2.2 桂花果实指纹图谱研究

2.2.1 供试品溶液的制备取适量桂花果实样品粉碎，过4 号筛，精密称定0.1 g 置离心管中，加入甲醇10 mL，准确称定质量，超声提取30 min，放冷后称量，用溶剂补足质量，随后样品放入离心机中离心10 min。取上清液过0.45 μm 微孔滤膜，待测。

2.2.2 对照品溶液的制备精密称定红景天苷、新女贞苷、毛蕊花糖苷、特女贞苷、异麦角甾苷、女贞苷G13、槲皮素、芹菜素、山柰酚对照品适量，置于10 mL 量瓶中，用色谱甲醇溶解定容，制得含上述对照品质量浓度分别为4.25、2.81、1.30、4.78、0.30、5.98、0.16、0.15、0.42 mg/mL 的混合对照品溶液。

2.2.3 精密度试验取桂花果实，按“2.2.1”项下方法制备供试品，按上述色谱条件连续进样6 次，以分离度较好且峰面积较大的特女贞苷为参照峰，考察各共有峰的相对保留时间与相对峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间RSD 值均小于1.0%，相对峰面积RSD 值均小于3.0%，表明仪器精密度良好。

2.2.4 重复性试验取桂花果实药材，按“2.2.1”项下方法平行制备6 份供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进样，以特女贞苷为参照峰，考察各共有峰的相对保留时间与相对峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间RSD 值均小于1.0%，相对峰面积RSD 值均小于3.0%，表明方法重复性良好。

2.2.5 稳定性试验取桂花果实药材，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，室温下放置，分别在0、2、4、8、12、24 h 后按“2.1”项下色谱条件进样，以特女贞苷为参照峰，考察各共有峰的相对保留时间与相对峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间RSD 值均小于1.0%，相对峰面积RSD 值均小于3.0%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.2.6 桂花果实HPLC 指纹图谱的建立及相似度评价将收集的20 批桂花果实（S1～S20），按“2.2.1”项方法制备供试品溶液，并按“2.1”项色谱条件下进样，得20 批桂花果实HPLC 色谱图（图1）。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）进行指纹图谱分析，以样品（S20）图谱为参照指纹图谱，用中位数法生成对照指纹图谱，采用多点校正后进行自动匹配。结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD 值均小于1.0%。对20 批桂花果实色谱图与对照指纹图谱进行相似度评价，发现S1～S20相似度均≥0.909（表2）。

图1 20 批桂花果实指纹图谱及其对照指纹图谱 (R)Fig.1 Fingerprints of 20 batches of O.fragrans fruits and their reference fingerprints (R)

表2 20 批桂花果实样品的指纹图谱与对照指纹图谱相似度评价结果Table 2 Similarity of fingerprint of 20 batches of O.fragrans fruits and their reference fingerprints

2.2.7 指纹图谱共有峰的指认与归属取“2.2.1”和“2.2.2”项下制备的桂花果实供试品溶液（S1）和混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，通过保留时间和UV 紫外图谱对照分析，确定4 号峰为红景天苷、9 号峰为毛蕊花糖苷、10 号峰为新女贞苷、11 号峰为特女贞苷、12 号峰为异麦角甾苷、16 号峰为女贞苷G13、17 号峰为槲皮素、18 号峰为芹菜素、19 号峰为山柰酚，混合对照品以及桂花果实样品的HPLC 色谱图见图2。

图2 混合对照品 (A) 和桂花果实样品 (B) 溶液的HPLC 图Fig.2 HPLC of nine mixed references (A) and sample of O.fragrans fruits (B)

2.3 桂花果实中9 种化学成分含量测定

2.3.1 色谱条件及供试品溶液、混合对照品溶液的制备同“2.1”“2.2.1”“2.2.2”项下方法。

2.3.2 线性关系考察按“2.2.2”项下方法制备含有红景天苷、毛蕊花糖苷、新女贞苷、特女贞苷、异麦角甾苷、女贞苷G13、槲皮素、芹菜素、山柰酚分别为262.7、16.4、8.8、285.5、1.6、369.3、1.0、1.0、3.0 μg/mL；525.4、32.8、17.7、571.1、3.2、738.6、2.0、2.0、5.0 μg/mL；1 050.9、65.6、35.3、1 142.1、6.4、1 477.2、4.0、4.0、10.0 μg/mL；2 101.8、131.2、70.6、2 284.2、12.8、2 954.4、8.0、8.0、21.0 μg/mL；4 203.5、262.4、141.2、4 568.4、25.6、5 908.9、16.0、16.0、41.0 μg/mL 的混合对照品溶液，置于1 mL 量瓶中，以甲醇定容，摇匀，得系列质量浓度的混合对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件依次进样测定，以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性分析，得各成分回归方程，结果见表3。结果表明，桂花果实中上述9 种化学成分在相应的质量浓度范围与峰面积的线性关系良好。

表3 桂花果实中9 种化学成分线性关系考察结果Table 3 Results of linear relation of constents of O.fragrans fruits

2.3.3 精密度试验取桂花果实样品按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录色谱峰面积，计算红景天苷、毛蕊花糖苷、新女贞苷、特女贞苷、异麦角甾苷、女贞苷G13、槲皮素、芹菜素和山柰酚各成分峰面积的RSD 值依次为2.02%、2.72%、2.65%、2.49%、2.97%、1.96%、2.93%、2.81%、2.57%，均小于3.0%。

2.3.4 重复性试验取同一批（S1）桂花果实样本，按“2.2.1”项下方法平行制备供试品溶液6 份，按“2.1”项下色谱条件连续进样，记录色谱峰面积，计算得红景天苷、毛蕊花糖苷、新女贞苷、特女贞苷、异麦角甾苷、女贞苷G13、槲皮素、芹菜素和山柰酚各成分质量分数的RSD 值分别为2.56%、2.95%、2.65%、2.79%、2.43%、2.62%、2.49%、2.51%、2.67%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验取同一批（S1）桂花果实样本，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别在0、2、4、8、12、24 h 进样测定，记录色谱峰面积，计算得红景天苷、毛蕊花糖苷、新女贞苷、特女贞苷、异麦角甾苷、女贞苷G13、槲皮素、芹菜素和山柰酚各成分峰面积的RSD 值依次为2.38%、2.56%、2.73%、2.97%、2.64%、2.51%、2.61%、2.47%、2.77%，表明供试品溶液在48 h 内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验取同一批（S1）桂花果实，精密称定6 份，每份0.05 g，分别加入红景天苷、毛蕊花糖苷、新女贞苷、特女贞苷、异麦角甾苷、女贞苷G13、槲皮素、芹菜素、山柰酚对照品13.57、0.67、0.10、15.95、0.10、13.99、0.04、0.03、0.10 μg，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积并计算回收率。结果表明，红景天苷、毛蕊花糖苷、新女贞苷、特女贞苷、异麦角甾苷、女贞苷G13、槲皮素、芹菜素、山柰酚的平均加样回收率依次为 98.0%、100.4%、101.5%、101.9%、98.1%、102.6%、102.1%、99.3%、99.9%，RSD 值分别为2.81%、0.58%、0.59%、2.38%、2.28%、1.17%、2.58%、2.24%、1.42%，表明该方法的回收率良好。

2.3.7 不同产地桂花果实样品含量测定为了分析不同产地桂花果实的质量差异，按“2.2.1”项下方法制备20个不同产地桂花果实供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算各样品中红景天苷、毛蕊花糖苷、新女贞苷、特女贞苷、异麦角甾苷、女贞苷G13、槲皮素、芹菜素、山柰酚的含量，结果见表4。

表4 不同产地20 批桂花果实中9 种化学成分含量测定结果Table 4 Determination of nine chemicals of 20 batches of O.fragrans fruits from different habitats

结果显示，特女贞苷、女贞苷G13 和新女贞苷为桂花果实中主要化学成分，其中，尤以特女贞苷和女贞苷G13 含量较高，二者质量分数范围分别为14.181～26.808 mg/g、24.252～40.338 mg/g。这一结果与文献报道桂花果实中特征性化学成分主要为环烯醚萜苷类成分一致[22]。另外，桂花果实中虽然检测到一定的黄酮类成分，但是它们的含量较低。因此，可以考虑采用特女贞苷和女贞苷G13 作为桂花果实质量评价的主要指标。从不同产地桂花果实化学成分测定结果来看，各地区桂花果实中环烯醚萜苷类成分的含量差异比较明显。其中，四川德阳地区的桂花果实中女贞苷G13 和特女贞苷含量最高。不同产地桂花果实中代表性成分的含量差异原因推测与不同产地的地理位置、气候、土壤等环境综合因素有关。同时，与购买的桂花果实的采集时间、储存条件或品种也有一定关联，具体的差异原因有待进一步分析。

3 讨论

3.1 提取溶剂的考察

为了考察不同提取溶剂对桂花果实含量测定结果的影响，平行称定8 份桂花果实样本1.0 g，置三角瓶中，分别加入100%、90%、70%和50%甲醇以及100%、90%、70%和50%乙醇各50 mL 进行超声提取，提取液过滤后进行HPLC 分析。结果显示，纯甲醇对桂花果实中各成分的提取效果最好，故选择100%甲醇作为本研究提取溶剂。

3.2 检测波长的选择

采用紫外检测器对桂花果实对照品及供试品溶液进行200～400 nm 全波长扫描。结果发现，桂花果实中环烯醚萜苷类成分：女贞苷G13，特女贞苷，新女贞苷和红景天苷分别在230、224、210、220 nm处有最大吸收，其他成分的最大吸收范围在220～375 nm。通过波长筛选，桂花果实中9 种化学成分在210 nm 处均能显示，且分离度和峰形良好，故选择210 nm 作为测定波长。