苏宏娜，李学学，张绍山，孔苑琳，谭 玲，赵雪莲，李奕松，李 进，陈仕勇，刘 圆

1.西南民族大学药学院，四川 成都 610225

2.四川省羌彝药用资源保护与利用技术工程实验室，四川 成都 610225

3.西南民族大学青藏高原研究院，四川 成都 610225

4.西南民族大学畜牧兽医学院，四川 成都 610225

5.西南民族大学民族医药研究院，四川 成都 610225

滇桂艾纳香作为广西壮医中的常用药材，具有活络经血、祛风除湿、止血、利尿等功效，用于治疗经期不准、产后大出血、不孕症、阴疮、风湿骨痛等症状[1-3]。《广西省药材标准（第2 册）》1996年版、《湖南省中药材标准》2009年版收载假东风草Blumea riparia(Bl.) DC.作为滇桂艾纳香的基原植物，别名白花九里明、华艾纳香等。课题组实地考察中发现和文献记载的“大花种”—东风草B.megacephala(Randeria) Chang et Tseng，别名大头艾纳香、管芽，在广西壮医中也常作为滇桂艾纳香使用[4-6]。假东风草（小花种）和东风草（大花种）均为攀援状草质藤本，依靠形态特征难以区分。林雀跃等[7]对假东风草和东风草的品种、资源分布等进行了系统梳理和调查，发现假东风草于1836年[1]被正式命名，而东风草于1974年[1]被命名并作为假东风草的变种，后来的研究中将二者分列为同属不同种植物，但仍有学者认为二者为一个植物种。

近年来，SCoT 分子标记技术发展迅速并应用于药用植物的遗传多样性研究，评价药用植物种内、种间的遗传多样性以及亲缘关系，对药用植物的种质资源保护、分子育种等方面有重要的价值；其具有操作简单、稳定性和重复性好、多态性高、遗传信息丰富等优点[8-10]。目前，利用SCoT 分子标记对假东风草和东风草的研究未见报道。因此，本研究拟采用SCoT 分子标记研究假东风草（小花种）和东风草（大花种）的亲缘关系，建立2 个品种的DNA指纹图谱，为快速、准确鉴别壮药材滇桂艾纳香的2 个常混淆基原植物假东风草和东风草提供分子鉴定方法，为后续种质资源鉴定提供新的技术参考，也为滇桂艾纳香药材的开发利用提供技术保障。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

假东风草（小花种）和东风草（大花种）均由课题组自采于广西百色市、南宁市，经西南民族大学刘圆教授、李莹副教授鉴定为假东风草B.riparia(Bl.) DC.和东风草B.megacephala(Randeria) Chang et Tseng，标本现存于西南民族大学民族药材标本馆，采集信息见表1。

Plant Genomic DNA Kit 植物基因组DNA 提取试剂盒（离心柱型）#S7412（天根生化科技北京有限公司），EDTA 2Na（Siker）和GEL RED 核酸染料（擎科），2×Es Taq Master Mix（北京康为世纪生物科技有限公司）。

1.2 仪器

SCIENTZ-48 高通量组织研磨器（宁波新芝生物科技股份有限公司）、Fresco 17 冷冻高速离心机（赛默飞世尔科技中国有限公司）、超微量分光光度计（thermo scientific 公司）、T100TMPCR 仪（BIO-RAD 公司）、DYY-6C 型电泳仪（北京六一生物科技有限公司）、Uhiversal hood II 凝胶成像分体系统仪（BIO-RAD 公司）。

2 方法

2.1 DNA 提取及浓度测定

取于液氮冷冻存贮的假东风草（小花种）和东风草（大花种）样品，剪碎，加液氮研磨，DNA 的提取参照DNA 提取试剂盒操作说明书。提取后对样品DNA 进行核酸纯度及浓度的检测，并经1.3%琼脂糖凝胶电泳检测，于−20 ℃冰箱中贮藏备用。

2.2 SCoT-PCR 扩增

PCR 扩增反应体系为2×Es Taq Master Mix 10 μL，10 μmol/L 引物2 μL，模板DNA 2 μL（约20 ng/μL），ddH2O 补足至20 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，退火1 min（不同SCoT引物的Tm值不同），72 ℃延伸1.5 min，彻底延伸10 min，共35 个循环。取扩增产物10 μL，用GelRed核酸染料染色，点样于1.5%琼脂糖凝胶上，在1×TAE 缓冲液中电泳80 min（120 V，400 mA）后摄取扩增图谱。

2.3 数据处理

选取条带清晰且多态性好的图谱进行统计，在同一迁移位置上，有条带记为“1”，无条带记为“0”，在Excel 表中建立1，0 矩阵，参考文献方法[10-13]构建假东风草和东风草的DNA 指纹图谱。利用软件DCFA1.1 将数据导入POPGENE 32中计算多态性条带百分比（PPB）。利用NTSYS-pc 2.10e 软件进行品种间的Dice 遗传相似性系数分析，并利用非加权组平均法（unweighted pair-group method with arithmetic mean，UPGMA）进行聚类分析[14-17]，构建假东风草和东风草聚类树状图。利用SPSS20.0 软件对假东风草和东风草进行主成分分析[18-19]，构建假东风草和东风草的主成分分析图。利用多态性最好的SCoT 引物构建指纹图谱。利用NTSYS-pc 2.1 分子进化软件计算假东风草和东风草的遗传距离，利用在线经纬度距离计算器（http://www.ab126.com/Geography/1883.html）计算假东风草和东风草的地理距离。利用R 语言进行Mantel test 分析[20-21]，对假东风草和东风草的遗传距离和地理距离进行spearman 相关性分析。

3 结果与分析

3.1 DNA 纯度及浓度检测结果

经检测，所有样品提取的DNA 的A260nm/A280nm在1.8～2.0，A260nm/A230nm在1.8～2.3，说明所有样品DNA 纯度达到检测要求。提取的DNA 质量浓度在23.7～256.9 ng/µL，用去离子水稀释至10 ng/µL进行后续实验。

3.2 SCoT 标记扩增结果及多态性分析

从23 条SCoT 引物中共筛选出11 条（表2）适合于30 个样本的SCoT-PCR 扩增，其电泳图见图1。用11 条SCoT 引物扩增30 个样本，共获得213条谱带，平均每个引物扩增出19.4 条谱带，其中多态性谱带209 条，比率为97.5%，表明假东风草（小花种）和东风草（大花种）的遗传多样性比较丰富。

表2 SCoT 引物序列Table 2 Primer information of SCoT

图1 假东风草 (小花种) 和东风草 (大花种) SCoT19 DNA 电泳图Fig.1 SCoT19 DNA electrophoresis of B.riparia (small flower species) and B.megacephala (big flower species)

3.3 SCoT 标记UPGMA 聚类分析

按照电泳图谱中同一位置上条带的有无进行统计，有记录为“1”，无记为“0”，形成Excel 数据矩阵。利用NTSYS-pc 2.1 分子进化软件对假东风草（小花种）和东风草（大花种）的遗传相似度进行数据处理，当遗传相似性系数为0.418 时，假东风草（1～10）单独成一支，且遗传性相似度为0.64，表明假东风草（小花种）遗传基础较窄，基因多样性较低；东风草（20～30）聚为一支，遗传相似度为0.49，东风草（11～19）聚为一支，遗传相似度为0.41，表明东风草（大花种）基因多样性较高，种内变异较大，遗传基础较宽泛。当遗传相似性系数为0.479 时，可以看出假东风草（1～10）与东风草（20～30）聚为一支，说明假东风草（1～10）与东风草（20～30）遗传基础具有一定的相似性，说明部分学者认为的东风草作为假东风草的一个变种具有一定依据，但实际从分子水平来看假东风草（1～10）和东风草（20～30）遗传相似系数仅为0.479，亲缘关系较远，说明传统的经验鉴别具有一定的局限性。假东风草和东风草的遗传相似度图见图2。

图2 假东风草 (小花种) 和东风草 (大花种) UPGMA聚类图Fig.2 UPGMA clustering graph of B.riparia (small flower species) and B.megacephala (big flower species)

3.4 SCoT 标记主成分分析

将数据矩阵导入SPSS 20.0 软件上对不同样本进行主成分分析，以特征值≥1 为原则提取2 个主成分，且累积贡献率达到87.59%，基本可以客观反映假东风草和东风草的样本信息。以主成分2 为纵 坐标，主成分1 为横坐标所形成的假东风草和东风草的位置分布如图3 所示。主成分分析结果表明可以区分假东风草和东风草，30 个假东风草和东风草样本被分为2 类。1～10 号样本为一类，均为假东风草；11～30 号样本为一类，均为东风草；在第2大类东风草中又可以分为2 小类，11～19 号样本为一小类，20～30 号样本为一小类，主成分分析结果与聚类分析结果相吻合，主成分分析结果更直观地表明了假东风草和东风草之间的亲缘关系，是对聚类结果的直观解释和佐证。

图3 假东风草 (小花种) 和东风草 (大花种) 主成分分析图Fig.3 PCA clustering graph of B.riparia (small flower species) and B.megacephala (large flower species)

3.5 假东风草和东风草DNA 指纹图谱构建

从筛选的11 条SCoT 引物中选择多态性最好的引物SCoT3 构建30 份假东风草和东风草DNA指纹图谱，见图4。由图可知该引物可鉴别所有假东风草和东风草的DNA 样品，因此，可利用SCoT3 引物对待测的假东风草和东风草进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，比对供试品的多态性与构建的DNA 指纹图谱，从而区分鉴定假东风草和东风草。

图4 假东风草 (小花种) 和东风草 (大花种) DNA 指纹图谱Fig.4 DNA fingerprint map of B.riparia (small flower species) and B.megacephala (big flower species)

3.6 种间遗传距离与地理距离相关性分析

利用NTSYS-pc 2.1 分子进化软件对假东风草和东风草的遗传距离进行数据处理，利用在线经纬度距离计算器（http://www.ab126.com/Geography/ 1883.html）计算假东风草和东风草的地理距离，假东风草和东风草遗传距离、地理距离见表3。遗传距离和地理距离的范围分别为0.146 0～1.350 8 和0.010 7～285.978 9 km，其中遗传距离最大值出现在8 号假东风草和17 号东风草之间，最小值出现在4 号假东风草和28 号东风草之间；地理距离最大值出现在4 号假东风草和11 号东风草之间，最小值出现在19 号东风草和23 号东风草之间。利用R 语言对假东风草和东风草的遗传距离和地理距离进行Mantel test 分析，permutations 设置为99 次，结果显示遗传距离与地理距离呈显著相关性（r＝0.392 9，P＝0.01）。

表3 遗传距离和地理距离Table 3 Genetic distance and geographic distance

4 讨论

SCoT 分子标记是一种新开发的基于植物基因中的翻译起始位点（ATG）侧翼保守序列的单引物分子标记，目前已广泛应用于植物遗传多样性及亲缘关系研究[16-17,20-23]。程印虎等[10]利用SCoT 分子标记对陕西产重楼属种质资源的遗传多样性分析发现，在相似系数为0.80 时，6 个类群重楼可以分为2 个类群，6 个类群重楼属植物在物种水平上具有较高的遗传多样性。陈大霞等[8]基于ISSR、SCoT、SRAP 标记对川续断属药用植物亲缘关系研究发现，分子标记揭示的结果与形态标记分类也有一定差异，峨眉续断与其原变种川续断在生境、繁殖方式及叶片形态上均有较大差异，二者之间的亲缘关系值得进一步研究。本研究通过SCoT 对假东风草（小花种）和东风草（大花种）的遗传多样性分析发现，在遗传相似度为0.418 时，假东风草（小花种）和东风草（大花种）被分为2 类，但部分东风草（大花种）和假东风草（小花种）遗传距离较近，植物形态有差异，二者之间的亲缘关系需要进一步探索和研究。

滇桂艾纳香是壮族常用的特色药材，目前广西省及湖南省中药材标准只收录了假东风草（小花种）作为其来源。随着滇桂艾纳香药材资源的开发，假东风草（小花）野外资源形式不宜乐观，且因东风草（大花种）在外观形态和药用价值与其具有一定的相似性，因此常出现将二者混淆的情况。本研究对实地收集的30 份假东风草和东风草资源进行SCoT-PCR 扩增，首次从分子水平建立了鉴别该2个易混淆品种的方法。本研究筛选的11 条SCoT 引物在假东风草（小花种）和东风草（大花种）中具有较高的多态性，平均多态性比率为98.12%，高于该方法研究地黄种质资源[21]和射干、川射干药材分子鉴别[24]的多态性百分比。

根据UPGMA 聚类分析结果，Dice 遗传相似性系数在0.421 处可将30 个样本分为3 大类，其中第I 类为假东风草，第II 类与第III 类均为东风草，可以将2 个品种区分开；根据主成分分析结果显示可以将30 个样本区分为2 大类，其中东风草又可细分为2 类，主成分分析结果与聚类结果一致。东风草存在有2 个分支，推测可能是由于在分化、进化过程中，东风草逐渐有分化出一个亚种的趋势。建议后续收集数量更多、分布范围更广的假东风草（小花种）和东风草（大花种）的种质资源，对其分化和进化过程进行更进一步研究，以期对假东风草（小花种）和东风草（大花种）的植物学分类做出分子水平的解释和参考。

根据本研究中SCoT3 引物构建的DNA 指纹图谱，可以区分30 份假东风草（小花种）、东风草（大花种），因此SCoT 分子标记可以在区分假东风草（小花种）和东风草（大花种）有效应用，可以达到快速、准确的区分假东风草（小花种）和东风草（大花种）的目的。假东风草（小花种）和东风草（大花种）为2 个同属独立的品种。此外，目前地方标准仅收载了假东风草作为滇桂艾纳香药材的植物来源，但实际壮医临床使用有假东风草（小花种）和东风草（大花种）2 个基原。建议进一步开展假东风草（小花种）和东风草（大花种）药效一致性评价等相关研究，探讨制药企业是否能够将东风草（大花种）纳入滇桂艾纳香新的基原植物，扩大药源，保证人民的用药安全，同时缓解假东风草（小花种）的药用资源不足的问题。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突