李玥，吴文静，甘璐，成睿珍

天津市滨海新区中医医院，天津 300450

肠系膜淋巴结炎为儿科临床常见病，多发于7岁以下儿童，且男孩发病率高于女孩[1-2]。临床上主要表现为腹痛，有时可伴有呕吐、腹泻、腹胀、便秘、食欲不振等症状，部分患儿还可能有白细胞升高、发热等表现，严重影响患儿的身心健康和生长发育[3-4]。然而，现代医学缺乏行之有效的治疗方法，目前多采用控制饮食、静脉滴注或口服抗生素抗感染、抗病毒、解痉止痛等治疗手段[5-6]，虽可缓解眼前腹痛症状，但治标不治本，不良反应大，患儿极易产生耐药性，导致腹痛再次发作，甚至引起其他疾病。

中医学认为，肠系膜淋巴结炎有寒、热、虚、实之分，病因多有内外之别。小儿由于脏腑娇嫩、形气未充、卫外功能不固、对寒暖不能自调，外易为六淫所侵，内易为饮食所伤，临床辨证多分为寒凝中焦、乳食积滞、脏腑虚寒、气滞血瘀等证型，治疗上多采用温中散寒、消食导滞、温中补虚、理气化瘀等治则[7-10]。

本研究选用天津市滨海新区中医医院儿科常用于治疗小儿肠系膜淋巴结炎的中药贴敷处方。此方结合临床辨证施治，已在临床广泛应用10余年，并取得良好疗效。处方主要由吴茱萸、木香、肉桂、丁香和小茴香等9味中药组成，功效为温中散寒、缓急止痛，主要用于治疗脾胃虚弱，感受寒邪，寒凝气滞导致的腹痛、腹泻、呕吐、厌食等症。辩证要点为食欲差、腹痛、腹胀，遇冷则重，得温则减，呕吐食物或清水，或大便溏，苔白或白腻。

方中吴茱萸味辛，性热，归肝、胃经，散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻；木香味辛、苦，性温，归脾、胃、大肠、三焦经，辛行气滞、苦消气结、行气止痛、健脾消食；丁香具有温中降逆、散寒止痛、温肾助阳之效；小茴香味辛，性温，归脾胃肝经，理气和胃、开胃健脾；延胡索味辛苦，性温，活血祛瘀、行气止痛。诸药合用，理气湿中、散寒止痛，共奏温中芳香、利湿止痛之功，配合口服中药汤剂及西医抗生素抗炎等治疗方法，能够有效地治疗小儿肠系膜淋巴结炎[11]。

1 材料

1.1 仪器

LC20A型高效液相色谱系统[LC-20AD泵、SIL-20AC型自动进样器、SPD-M20A型二极管阵列检测器、CTO-20A型柱温箱、CBM20Alite型控制器、DGU-20A3R(C)型脱气机、LabSolutions色谱工作站，日本岛津公司]；AL-204型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；KQ-300DE型台式数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

对照品吴茱萸碱、吴茱萸次碱、木香烃内酯和去氢木香烃内酯(上海源叶生物科技有限公司，批号分别为DC-18031410、DC-18031411、DC-17101310、DC-17101311，纯度≥98%)；对照品桂皮醛和丁香酚(北京北纳创联生物技术研究院，批号分别为BWB52030、BWB50285，纯度≥98%)；超纯水为自制；甲醇为色谱纯。

小儿肠系膜淋巴结炎中药复方包括吴茱萸、木香、丁香、肉桂、小茴香等9味中药饮片，由天津市滨海新区中医医院药学科提供，经刘海副主任中药师鉴定，均符合《中华人民共和国药典》2015年版中规定。

2 方法与结果

2.1 中药复方水提液的制备

小儿肠系膜淋巴结炎中药复方由吴茱萸20 g、木香20 g、丁香10 g、肉桂10 g、苍术20 g、小茴香20 g、车前子10 g、延胡索20 g和白胡椒30粒组成。

称取以上9味中药饮片，粉碎为粗粉后置于圆底烧瓶中，随后分别加入适量的蒸馏水，浸泡30 min后，开启电热套进行回流提取，趁热滤过，浓缩至适量，放冷至室温，加水定容至500 mL，混匀，备用。

2.2 指标成分的含量测定

2.2.1供试品溶液的制备 分别精密移取以上水提液1 mL，用无水甲醇稀释2倍，混匀，醇沉，滤过，取续滤液，备用。

2.2.2色谱条件 Agilent Eclipse Plus C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)；甲醇(A)-水(B)为流动相，梯度洗脱(0～7 min，39%A；7～15 min，39%～58%A；15～38 min，58%A；38～40 min，58%～79%A；40～52 min，79%A；52～52.5 min，79%～39%A；52.5～65 min，39%A)；流速：1 mL·min-1；柱温：35 ℃；检测波长为200～400 nm；进样量为10 μL。色谱图见图1。

注：A.空白溶液；B.混合对照品溶液；C.供试品溶液；1.吴茱萸碱；2.木香烃内脂；3.去氢木香烃内脂；4.桂皮醛；5.丁香酚；6.吴茱萸次碱。图1 空白溶液、混合对照品及小儿肠系膜淋巴结炎中药复方汤剂供试品溶液的HPLC图

2.2.3对照品溶液的制备 分别取吴茱萸碱、吴茱萸次碱、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、桂皮醛和丁香酚对照品适量，精密称定，置10 mL量瓶中，用70%甲醇溶解，定容至刻度，摇匀。得质量浓度分别为38.70、19.40、61.36、74.00、70.20、677.56 μg·mL-1的混合对照品储备液。

2.2.4阴性供试品溶液的制备 称取含指标成分以外的其他药味，按2.1和2.2.1项下方法制备阴性供试品。

2.2.5线性关系考察 精密移取上述混合对照品储备液，用70%甲醇逐级稀释，制成一系列不同质量浓度的对照品溶液。按2.2.2项下色谱条件进样分析，记录色谱图和峰面积。分别以各指标成分的峰面积为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)进行线性回归分析，得线性回归方程分别为吴茱萸碱Y=29 997.55X+9 984.91(r=1.000 0)、吴茱萸次碱Y=71 925X+170 22(r=0.999 6)、木香烃内酯Y=24 169.895X+21 941.38(r=0.999 6)、去氢木香烃内酯Y=13 531.06X+11 520.07(r=0.999 6)、桂皮醛Y=36 052X+34 794(r=0.999 6)和丁香酚Y=2 910 800X+120 550(r=0.999 6)，其线性范围分别为0.604 7～38.700 0、0.001 1～19.400 0、0.003 7～61.360 0、0.004 6～74.000 0、0.004 4～70.200 0、0.040 0～677.560 0 μg·mL-1。以上结果表明，各成分在各自的质量浓度范围内线性关系良好。

2.2.6精密度试验 精密吸取高、中、低3种不同质量浓度的混合对照品溶液，按2.2.2项下色谱条件进样分析，连续进样6次，测定6种成分的峰面积，计算各成分的含量，求日内、日间精密度。吴茱萸碱、吴茱萸次碱、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、桂皮醛和丁香酚的日内精密度RSD分别为 0.72%、1.14%、1.20%、1.81%、1.06%和1.00%。日间精密度的RSD分别为 1.73%、2.60%、2.07%、2.90%、2.04%和1.97%。结果表明，仪器的日间、日内精密度良好。

2.2.7重复性试验 取处方按2.1项下方法制备水提液，按2.2.1项下方法制备供试液共6份，按2.2.2项下色谱条件进样分析，测定吴茱萸碱、吴茱萸次碱、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、桂皮醛和丁香酚6种成分的峰面积，计算各成分含量的RSD分别为1.19%、2.14%、1.29%、2.69%、1.70%和1.26%。结果表明，此法重复性良好。

2.2.8稳定性试验 取处方按2.1项下方法制备水提液，按2.2.1项下方法制备供试品溶液1份，按2.2.2项下色谱条件分别于0、4、8、12、16、20、24 h进样分析，测定吴茱萸碱、吴茱萸次碱、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、桂皮醛和丁香酚6种成分的峰面积，计算各成分含量的RSD分别为0.20%、0.29%、1.06%、0.63%、1.12%和0.92%。结果表明，供试品溶液在室温下24 h内稳定。

2.2.9加样回收率试验 精密量取已知6种指标成分含量的供试液6份，分别加入等量的对照品，按2.2.2项下色谱条件测定，记录峰面积，计算加样回收率。测得吴茱萸碱、吴茱萸次碱、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、桂皮醛和丁香酚的平均回收率分别为100.33%、98.90%、100.70%、99.44%、99.42%和102.75%，其加样回收率的RSD分别为2.05%、1.74%、3.00%、2.85%、1.94%和2.83%，见表1。

表1 小儿肠系膜淋巴结炎中药复方汤剂中6个成分加样回收率结果

2.3 水提工艺的优选

2.3.1单因素考察

2.3.1.1提取溶剂用量的考察 按处方量称取各味药，分别加入4、6、8、10和12倍量水回流提取1次，每次1 h，平行3份。按2.2.1项下方法制备供试品溶液，按2.2.2项下色谱条件进样分析，测定吴茱萸碱、吴茱萸次碱、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、桂皮醛和丁香酚的峰面积，计算各成分的相对含量。根据各指标含量的变化，正交试验设计选择加水量为8、10和12倍量(图2)。

图2 单因素考察加水量对各指标成分提取量的影响

2.3.1.2提取时间的考察 按处方量称取各味药，加入6倍量水，分别回流提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，提取1次，平行3份。按2.2.1项下方法制备供试品溶液，按2.2.2项下色谱条件进样分析，测定吴茱萸碱、吴茱萸次碱、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、桂皮醛和丁香酚的峰面积，计算各成分的相对含量(图3)。根据各指标含量的变化，正交试验设计选择提取时间为1.5、2.0、2.5 h。

图3 单因素考察提取时间对各指标成分提取量的影响

2.3.2多指标成分权重系数的确定 对处方中君臣佐使及其指标成分的含量进行分析，将吴茱萸碱、吴茱萸次碱、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、桂皮醛和丁香酚6种成分的权重系数分别设定为0.25、0.25、0.15、0.15、0.10和0.10。

2.3.3正交试验设计 在单因素试验的基础上，又将提取次数作为其中的考察指标。采用正交设计ⅡⅤ3.1筛选最佳工艺，选择三因素三水平，按L9(34)正交设计进行试验(表2)。以吴茱萸碱等6种成分为测定指标，采用加权综合评分法，对实验结果进行统计，以指标成分含量的综合评分值对实验结果进行直观分析(表3)和方差分析(表4)，确定最佳提取工艺。

表2 小儿肠系膜淋巴结炎中药复方汤剂正交试验因素设计

表3 小儿肠系膜淋巴结炎中药复方汤剂中6种指标成分的正交试验结果

表4 中药复方汤剂中6种指标成分的综合评分方差分析

2.3.4多指标综合评分分析 由表3的R值直观分析和表4方差分析可知，各考察因素对考察指标影响大小的次序为C>A>B，其中C影响差异有统计学意义(P<0.05)，A和B在实验所设范围内无差异。综合正交设计结果、时间和成本问题，得出最佳试验方案为A1B1C3，即8倍量水，提取1.5 h，提取3次。

2.3.5验证实验 为了进一步验证所选最优工艺，按照优选的水提工艺进行3组验证实验。由结果可知，吴茱萸碱、吴茱萸次碱、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、桂皮醛和丁香酚的相对质量分数分别为702.25、101.88、102.79、376.17、210.69、1.38 mg·g-1，RSD分别为1.97%、2.11%、2.06%、2.15%、1.67%和1.61%。结果表明，该工艺稳定、可行。

3 讨论

3.1 考察指标及权重系数的确定

本研究通过对主要药味的有效成分进行含量测定，根据复方中不同药味的地位分配权重，进行多指标成分权重分析。方中吴茱萸为君药，其中吴茱萸碱和吴茱萸次碱是其发挥助阳、散寒止痛功效的物质基础。研究表明，其可对醋酸引起小鼠扭体反应有镇痛效果[12]，故将吴茱萸碱和吴茱萸次碱的权重系数均定为0.25。臣药木香辛行气滞、苦消气结，其中具有抗炎、止痛的有效成分为萜类木香烃内酯和去氢木香烃内酯，能够抑制一氧化氮(NO)的产生和核转录因子(NF)-κB的活化[13-15]，故将木香烃内酯和去氢木香烃内酯权重系数均定为0.15。肉桂和丁香均为辛香之品，为佐药，其挥发性成分桂皮醛和丁香酚能够温中散寒、止痛，具有良好的体外抗菌、抗炎作用，不良反应小，将其权重系数均定为0.1。因此，本研究综合相关文献的报道，选择以上各指标作为考察对象，理论上对小儿肠系膜淋巴结炎起到很好的治疗作用。

3.2 色谱条件的优化

根据各指标成分的理化性质，即吴茱萸碱和吴茱萸次碱为生物碱类，木香烃内酯和去氢木香烃为内酯萜类，而桂皮醛和丁香酚为极性较小的挥发性成分，结合文献报道的各成分HPLC含量测定的方法[16-18]，本研究采取梯度洗脱的方法，于不同吸收波长采集色谱数据，测定各成分的相对含量。经方法学考察发现，该方法科学合理、可行稳定，适于此复方中6种指标成分的含量测定。

3.3 提取工艺的优选

中药复方在传统的水回流提取工艺研究过程中，提取时间、提取次数和加水量等因素对实验结果的影响十分重要。为了全面反映该汤剂对小儿肠系膜淋巴结炎的作用效果，并将其有效成分充分提取出来，笔者通过前期的文献调研，结合单因素考察的结果，确定正交试验设计的因素水平，通过对主要药味的有效成分进行含量测定，根据复方中不同药味的地位分配权重，进行多指标成分权重综合评分分析。本研究综合正交设计结果、时间和成本问题，得出该汤剂的最佳提取工艺为8倍量水，提取3次，每次1.5 h。

此外，本研究在小儿肠系膜炎中药复方汤剂的提取工艺实验研究中，充分考虑方中君、臣、佐、使的配伍原则及其有效成分的药理特性[19]，运用单因素分析结合正交试验-多指标综合评分的方法，确定该汤剂的提取工艺并进行了验证。该研究具有一定的科学性，可为后续制剂工艺的筛选、评价新药的研发提供参考。