孙一帆，任广喜，史启今，姜丹，刘春生

北京中医药大学 中药学院，北京 102488

甘草为豆科甘草属植物乌拉尔甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、光果甘草G.glabraL.或胀果甘草G.inflateBat.的干燥根及根茎，始载于《神农本草经》，是我国最常用的大宗药材之一，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛等功效[1]。甘草酸是甘草的主要活性成分之一。现代药理学研究表明，甘草酸具有抗肿瘤[2]、抗炎[3]、保肝[4]、免疫调节[5]、抗病毒[6]和抗癌[7]等药理活性，在药品、保健品、食品添加剂、化妆品等行业广泛应用，需求量日渐增多[8-9]。野生甘草资源经历多年的掠夺性采挖，已日趋枯竭[10-11]。目前，栽培甘草是甘草药材的主要来源[12]。研究表明，不同产地野生和栽培甘草的甘草酸含量存在显著差异，栽培甘草的甘草酸含量多数达不到《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)2020年版规定2.0%的最低标准[13]。因此，提高栽培甘草的甘草酸的含量是甘草产业发展中亟须解决的问题之一。

内生真菌(endophytic fungi)是一类定殖在植物体内且不会对宿主植物造成致病性影响的微生物，对植物的生长、发育、适应性和多样化产生重要的影响[14-16]。1993年，Stierle等[17]首次从短叶紫杉TaxusbrevifoliaNutt.中分离出产紫杉醇(paclitaxel)的内生真菌Taxomycesandreanae。截至目前，已从不同的药用植物中分离出能够合成喜树碱(camptothecin)[18]、石杉碱甲(huperzine A)[19]、罗汉果苷Ⅴ(mogroside Ⅴ)[20]、丹参酮Ⅰ(tanshinone Ⅰ)和丹参酮ⅡA(tanshinone ⅡA)[21]、长春碱(vinblastine)和长春新碱(vincristine)[22]等复杂构型化合物的内生真菌。此外，内生真菌也能促进宿主植物次生代谢产物的积累。在药用植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.中分离的1株曲霉属内生真菌Trichodermaatroviride，其菌丝体提取物能够促进丹参毛状根的生长和丹参酮的生物合成[23]。将红豆杉TaxuscuspidateSieb.et.Zucc.悬浮细胞与一株镰刀属内生真菌Fusariummairei共培养，5 d后共培养体系中紫杉醇的含量是对照组的2倍[24]。将1株Anteaglonium属内生真菌T010重新定殖至蓝莓Vacciniumcorymbosum幼苗的根部，通过比较转录组分析发现，内生真菌定殖后引起了蓝莓幼苗的细胞代谢、生物合成和信号通路的变化，并促进幼苗生长[25]。上述研究表明，内生真菌不仅能够合成药用天然化合物，而且在促进植物生长和次生代谢产物合成等方面具有极大的潜力。

内生真菌的种类和多样性受多种因素的共同影响，包括宿主植物的种类、生长环境、生长年限、气候条件等。研究表明，内生真菌与药用植物的生长、发育和成分积累等密切相关，进而对药材的道地性产生影响[26-27]。通过比较道地和非道地产区的牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.[28]、丹参[29]、川芎LigusticumchuanxiongHort.[30]等药用植物内生真菌的种类，发现道地产区的药材通常携带更多特有种类的内生真菌。本课题组前期比较了不同产地栽培甘草内生真菌的多样性，发现道地产区甘草内生真菌的分离率、定殖率、多样性指数均高于非道地产区[31]。然而，关于野生和栽培2种不同的生长环境对甘草内生真菌种类多样性的影响鲜有报道。因此，本研究以2种不同生境(野生和栽培)的甘草为研究对象，分离、鉴定两者的内生真菌，系统分析比较2种不同生境甘草的内生真菌种类和多样性，为甘草内生真菌资源利用和开发提供参考，也为进一步研究内生真菌对野生和栽培甘草药材的质量影响提供理论依据。

1 材料

1.1 样品

5年生野生甘草于2019年6月份采自内蒙古鄂尔多斯市杭锦旗吉日嘎朗图镇(E107.94°W40.79°)，5年生栽培的甘草采自北京中医药大学望京药园(E116.42°W39.97°)。挖取新鲜健康的甘草根(无病斑伤口或腐烂)，采后迅速放入液氮保存。样品经北京中医药大学中药学院刘春生教授鉴定为乌拉尔甘草GlycyrrhizauralensisFisch.。

1.2 试药

内生真菌分离培养基由本实验室配制。马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基：取200 g去皮的土豆切成小块，加入去离子水煮沸30 min；8层纱布过滤，向滤液中加入琼脂20 g，葡萄糖20 g，定容至1 L，121 ℃灭菌30 min。

75%乙醇(批号：KGDN6，北京百诺威生物科技有限公司)；琼脂(批号：A7002)、葡萄糖(批号：S11022)、一次性塑料培养皿(批号：JSHM0125)、甘油(批号：S24784)、乳酸酚棉蓝(LPCB)染色液(批号：S0245)、TAE缓冲液50×(批号：BN20121)均购于北京拜尔迪生物技术有限公司；真菌基因组DNA提取试剂盒(批号：D2300，北京索莱宝科技有限公司)；Trans2K®DNA Marker(批号：BM101-01)、琼脂糖(批号：GS201-01)、2×EasyTaq®聚合酶链式反应(PCR) SuperMix(+dye) 酶(批号：AS111-11)均购于北京全式金生物技术有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 仪器

LS-B35型立式压力蒸汽灭菌器(江阴滨江医疗设备厂)；3K15型台式高速冷冻离心机(德国SIGMA公司)；SW-CJ-1D型洁净工作台(江苏苏州苏洁净化设备厂)；JY-SP3型水平电泳槽(北京君意东方电泳设备有限公司)；PowerPac Basic Power Supply型基础电泳仪、GelDoc 2000型凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；HZQ-F100型立式恒温振荡培养箱(北京东联哈尔滨仪器制造有限公司)；Research Plus型单道可调量程移液器(德国Eppendorf公司)；MM400型混合冷冻球磨仪(德国Retsch公司)；ML51型生物显微镜(广州市明美光电技术有限公司)；Veriti 96型梯度PCR仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；GL-88B型旋涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。

2 方法

2.1 样品处理

先用树枝剪将新鲜的甘草根剪成长约5 cm的甘草小段，再用流动的自来水冲洗1 h，最后用滤纸吸干水分，备用。样品在4 ℃冰箱中保存不超过2周。

2.2 甘草的表面消毒及内生真菌的分离

在超净工作台中，用75%乙醇和0.1%升汞对甘草小段进行表面消毒。表面消毒方法：先用0.1%升汞消毒8 min，无菌水漂洗1 min；再用75%乙醇消毒1 min，无菌水漂洗1 min并重复漂洗5次；最后用无菌滤纸吸干表面水分。将甘草小段切成0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm的组织块，置于PDA培养基平皿中，每皿1块。采用组织印迹法和漂洗液检测法作为对照处理[32]，以验证表面消毒是否彻底。将接种甘草组织块的培养基置于28 ℃恒温培养箱中黑暗倒置培养7 d。采用菌丝尖端纯化法，挑取组织块表面新生的菌丝接种于新的PDA培养基中，反复分离纯化直到形成单一菌落。采用PDA斜面试管保存和甘油冻存法进行内生真菌的保存[33]。

2.3 内生真菌的形态学和显微学鉴定

形态学：每天观察并记录PDA平皿中菌落的直径、颜色、形态、生长速度。显微学：先在无菌载玻片的中央滴加1滴乳酸酚棉蓝染色液，再用解剖针挑取少量菌丝，混匀染色30 s；最后，加入1滴甘油，盖上盖玻片并轻轻压片。在光学显微镜下观察真菌的孢子结构、菌丝特征、有无横隔并进行拍照。参考《真菌鉴定手册》[34]、《中国真菌志》[35]等，初步鉴定内生真菌。

2.4 内生真菌的分子鉴定

利用真菌基因组DNA提取试剂盒提取内生真菌基因组DNA。采用真菌通用引物内转录间隔区(ITS)1和ITS4进行PCR扩增反应，引物序列：ITS1(5′-TCCGTAGGTG AACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3′)。扩增体系：DNA模板1 μL，正反引物各1 μL，2×EasyTaq®PCR SuperMix (+dye) 15 μL，dd H2O补至30 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min(30个循环)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，阳性结果送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。利用ContigExpress 9.10软件对测序结果进行拼接，将拼接序列在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行Blast比对。利用软件MEGA 7.0进行聚类分析，应用邻接法(neighbor-joining，NJ)构建系统进化树，kimura 2-parameter model计算进化距离，1000次重复检验发育树的可靠性。

2.5 统计分析方法

统计2种不同生境甘草内生真菌的分离率(isolation rate，IR)、相对频率(relative frequency，RF)、多样性指数/Shannon-Wiener指数(H)和相似系数/Sorenson系数(CS)[36]。

IR=(组织块中得到的菌株数/总组织块数)×100%

(1)

RF=(分离的某种内生真菌的菌株数/总菌株数)×100%

(2)

(3)

(3)式中，n指内生真菌种类的总数，Pi指某种内生真菌的数量占全部内生真菌总数的百分数。

CS=2j/(a+b)

(4)

(4)式中，j指2种不同生境甘草共有的内生真菌种类数，a是野生生境甘草内生真菌的种类数，b是栽培生境甘草内生真菌的种类数。以上数值均利用SPSS 22.0进行计算。

3 结果与分析

3.1 甘草内生真菌ITS序列PCR扩增结果

本实验从2种不同生境的甘草中各取220个组织块，分别分离得到214株和151株内生真菌，共计365株。提取全部菌株的基因组DNA，以每株内生真菌的DNA为模板，ITS1和ITS4为引物，扩增得到500～750 bp的条带，电泳结果见图1。

注：M.DNA marker；1～18.不同的菌株。图1 2种不同生境甘草部分内生真菌的rDNA ITS序列PCR扩增条带

3.2 甘草内生真菌的形态、显微及分子鉴定

统计每株内生真菌的菌落形态特征和菌丝体显微特征，利用NCBI数据库Blast比对rDNA ITS的测序拼接结果，下载相似度最高的菌株序列，构建系统进化树分析亲缘和进化关系，最后结合形态学、显微学进行菌种鉴定，归属为4纲5目6科9属30种内生真菌(表1)。部分菌株的具体形态学、显微学和分子鉴定结果见表2、图2～3。

表1 2种不同生境甘草内生真菌的分类结果

续表1

表2 甘草部分内生真菌的同源菌株信息

注：A～K.依次为菌株L11、E9、Y9、尖孢镰刀菌、多见镰孢菌、腐皮镰刀菌、C4、C5、Y4、损毁链格孢、青霉菌；A1～K1.菌株正面；A2～K2.菌株背面；A3～K3.菌丝和孢子的显微特征。图2 甘草部分内生真菌的形态和显微特征(LPCB,×400)

注：红色方框表示本研究中分离的内生真菌编号。图3 甘草部分内生真菌与同源菌株的聚类分析

3.2.1菌株L11 在PDA培养基中，该菌株有稀疏的白色菌丝；菌落开始是褐色，随后颜色逐渐加深，最后为深褐色；分生孢子梗有重复分枝，有单生，顶部较细；小型分生孢子大量产生，无色，椭圆形。

将菌株L11 ITS测序结果进行Blast比对，结果显示与菌株L11相似度最高的同源性序列均为无性世代Dactylonectria属真菌，相似度最高为99.78%，构建系统进化树分析显示L11与Dactylonectriamacrodidyma亲缘关系最近。综合以上鉴定结果及查阅参考文献[37]，鉴定菌种L11为Dactylonectria属真菌D.macrodidyma。

3.2.2菌株E9 在PDA培养基中，该菌株的菌丝为白色，边缘整齐，较疏松，菌落底部有橙黄色色素产生；分生孢子梗扫帚状分枝，分生孢子椭圆形。

将菌株E9 ITS测序结果进行Blast比对，结果显示菌株E9与生赤壳科螺旋聚孢霉属粉红粘帚菌Clonostachysrosea的相似度最高，为99.47%。综合以上鉴定结果及查阅参考文献[38]，鉴定菌E9为粉红粘帚菌C.rosea。

3.2.3菌株Y9 在PDA培养基中，该菌株的菌落呈白粉色，气生菌丝绒状，产生大型分生孢子和小型分生孢子；大型分生孢子镰刀型，有1个隔膜，小型分生孢子卵形或椭圆形；产孢结构为单瓶梗，厚垣孢子多，球形。

将菌株Y9 ITS测序结果进行Blast比对，结果显示菌株Y9与4株丛赤壳科镰刀属真菌的相似度最高，构建系统进化树分析显示Y9与Fusariummoniliformis亲缘关系最近。综合以上鉴定结果及查阅参考文献[39]，鉴定菌Y9为镰刀属真菌F.moniliformis。

3.2.4菌株C4 在PDA培养基中，该菌株的菌丝呈白色至褐色，较稀疏，气生菌丝呈毡状；菌落背面褐色，边缘白色；孢子长椭圆形，气生菌丝不分枝或少分枝。

将菌株C4 ITS测序结果进行Blast比对，结果显示与菌株C4相似度较高的同源性序列共3条，相似度最高为99.56%，构建系统进化树分析显示C4与Ilyonectriadestructans亲缘关系最近。综合以上鉴定结果及查阅参考文献[40]，鉴定菌株C4为土赤壳属真菌I.destructans。

3.2.5菌株C5 在PDA培养基中，该菌株的菌落呈白色丝绒状，边缘整齐，厚度适中，培养基背面黄色，分生孢子梗分支或少分支，褐色，或只有产孢细胞；产孢细胞为产孢瓶体，无色，近无色至中度褐色；分生孢子单胞，无色或近无色，黏孢子，解离。

将菌株C5 ITS测序结果进行Blast比对，结果显示与菌株C5相似度较高的同源性序列共3条，相似度最高为100%，构建系统进化树分析显示C5与Cadophorafastigiata亲缘关系最近。综合以上鉴定结果及查阅参考文献[41]，鉴定菌株C5为背芽突霉属真菌C.fastigiata。

3.2.6菌株Y4 在PDA培养基中，该菌株的菌落呈绒状，灰绿色或棕色；新生菌丝表面白色，成熟时变成橄榄绿色；菌丝分枝、分离。产孢部分合轴式延伸，分生孢子梗橄榄褐色至褐色，圆柱形、纺锤形、椭圆形；分生孢子梗分支，在分支链中产生大量分生孢子，在链的末端有较小尺寸的分生孢子。分生孢子顶生或侧生，呈单个、深色、椭圆形或圆柱形；分生孢子通过分生孢子梗顶端或侧面壁上的孔发育，链状、多分支的孢子链含有5～11个孢子。

将菌株Y4 ITS测序结果进行Blast比对，结果显示与菌株Y4相似度较高的同源性序列均为分子孢子菌属真菌，相似度最高为99.82%，构建系统进化树分析显示Y4与Cladosporiumcladosporioides亲缘关系最近。综合以上鉴定结果及查阅参考文献[42]，鉴定菌株Y4为枝状枝孢菌C.cladosporioides。

3.3 2种不同生境甘草内生真菌的多样性比较

本实验从野生生境的甘草中分离得到214株内生真菌，共归属为9个属，镰刀属(62.62%)和曲霉属(12.15%)为优势菌属，其次是链格孢属(8.41%)；从栽培甘草中分离得到151株内生真菌，共归属为6个属，镰刀属(62.91%)和土赤壳属(12.58%)为优势菌属，其次是青霉属(7.95%)；综合本次实验结果，镰刀属真菌是甘草内生真菌的优势菌属(62.74%)，其次是曲霉属(10.14%)；螺旋聚孢霉属(0.27%)、背芽突霉属(1.37%)、分子孢子菌属(1.37%)和Dactylonectria属(3.01%)内生真菌均为稀有菌属，结果见表3、图4。

表3 野生和栽培生境甘草内生真菌的相对频率和多样性指数

图4 野生和栽培生境甘草不同属内生真菌的比例

从野生生境甘草分离的特有菌株有交链孢霉、枝状枝孢菌、粉红粘帚菌、串珠镰刀菌、Fusariumfalciforme、Cadophorafastigiata等11种真菌；IR用于衡量2种不同生境甘草内生真菌的丰富度和每个组织块受多重侵染的频率，2种生境甘草内生真菌的分离率为97.27%(野生)和68.64%(栽培)；H用于比较2种不同生境甘草内生真菌的物种多样性程度，野生生境甘草内生真菌的H是栽培甘草的1.42倍；CS可以比较2种生境甘草内生真菌种类的相似程度，2种生境甘草内生真菌的CS为77.55%，表明野生生境甘草内生真菌的群落丰富度和多样性高于栽培甘草。

4 讨论

本研究从2种不同生境的乌拉尔甘草中共分离得到365株内生真菌，归属为4纲5目6科9属30种。在甘草中首次分离得到土赤壳属真菌，此外还分离出11株野生生境甘草特有的内生真菌，极大地丰富了甘草内生真菌的种类。

比较不同属内生真菌的分离率可以确定优势菌属。邓毅等[43]从甘肃野生乌拉尔甘草中分离得到7株内生真菌，优势菌属为青霉菌属和曲霉属；从栽培甘草中分离得到6株内生真菌，优势菌属为青霉菌属。杨明俊等[44]从乌拉尔甘草中分离得到36株内生真菌，归属为7个属，优势菌属为木霉属Trichoderma。吴桐等[45]从乌拉尔甘草中分离得到46株内生真菌，优势菌属为镰刀属。本实验从野生和栽培生境的甘草中各取220个组织块，共计分离365株内生真菌，结果表明，甘草内生真菌的优势菌属为镰刀属。镰刀属真菌是主要的植物病原属，也是植物内生真菌的常见菌属[46]。与前人相比，本研究用于分离内生真菌的甘草组织块数量较多，分离鉴定的内生真菌数量较多，确定优势菌属更具代表性。

药用植物内生真菌具有地域分布的差异性，与其他区域的同种植物相比，同一区域植物微生物种类的相似度更高，这是经过长期的自然选择形成的鲜明的微生态地域特征[47]。本研究发现野生生境甘草内生真菌的丰富度和多样性高于栽培生境甘草。从野生生境甘草中分离出11种特有菌株，该现象与2种甘草的生境差异密切相关。野生生境甘草采自内蒙古鄂尔多斯市杭锦旗，是甘草的传统道地产区，而栽培甘草种植于北京中医药大学望京药园，非道地产区。2种生境的气候类型、土壤类型、物种丰富度均差异较大。杭锦旗属中温带半干旱高原大陆性气候，光照充足、降水量小、蒸发量大、土壤微生物种类丰富、野外环境变化较大。北京属于温带季风性气候，植物园生长环境条件单一，土壤微生物的丰富度低于野外环境。因此，野生生境甘草在生长过程中面临更多生物或非生物胁迫，被不同种类微生物侵染的概率大，从而使分离的内生真菌种类丰富。

药用植物内生微生物以不同的方式直接或间接影响药材的生长、性状、代谢、化学成分等。目前，已检测到某些内生真菌可以产生3-吲哚乙酸等生长激素，促进药用植物的生长，因此药用植物内生真菌对药材品质及效用产生一定的影响[47]。有研究报道，野生甘草与栽培甘草的形态和化学成分存在一定的差异[48]，该差异可能与两者内生真菌的群落结构相关。因此，研究野生和栽培生境甘草内生真菌的种类和多样性差异，可以为提高栽培甘草的品质奠定基础。

不同植物内生真菌的次生代谢产物具有特异性，可以产生与宿主植物相同或相似的次生代谢产物。Zhang等[42]从蛇足石杉HuperziaserrataTrev.叶片中分离到1株能产生石杉碱甲的内生真菌LF70，通过形态和rDNA ITS序列比对，鉴定为枝状枝孢菌Cladosporiumcladosporioides。从红豆杉树皮中分离到同种菌株MD2，在马铃薯葡萄糖液体培养基生长时可以产生紫杉醇[49]。枝孢属真菌包括30多种，枝状枝孢菌是最常见的种类之一，能够产生枝孢菌素(cladosporin)、大黄素(emodin)和其他毒性较小的物质[50]。本研究从野生生境甘草中也分离出枝状枝孢菌，命名为Y4，未从栽培生境甘草中分离到同种菌株，这为筛选能够合成甘草次生代谢产物的菌株提供丰富的内生真菌资源。

综合以上结果，本研究通过分离、鉴定、分析和比较365株野生和栽培生境的甘草内生真菌，发现野生生境甘草内生真菌具有更高的丰富度和多样性，为进一步研究内生真菌对药材质量的影响提供新的思路，也为药用植物内生微生物的资源利用和开发提供参考。