冯 阳，贺 凡，涂珍珍，臧丹丹，倪鸣岳，周海胜,

G蛋白偶联受体107(G protein-coupled receptor 107，GPR107)是G蛋白偶联受体超家族成员，因尚未找到其天然配体，属于孤儿受体。人类GPR107的cDNA最先从肺组织中获得克隆。GPR107蛋白结构分析显示其N-末端存在疏水的信号肽和7个跨膜区，这是G蛋白偶联受体超家族成员的典型特征。GPR107在系统发育上高度保守，有研究表明GPR107与网格蛋白和逆转录蛋白VPS35结合，并且可能负责受体从内细胞室返回质膜，GPR107可能是与G蛋白结合以调节细胞内囊泡运输的受体之一。

为了过量表达GPR107蛋白并确定其亚细胞定位，利用分子克隆技术构建质粒pCMV-Tag2B-GPR107，将其转染至人胚肾上皮细胞(HEK 293T)，通过Western blot、激光共聚焦等方法，观察转染前后GPR107在体内的表达变化及其亚细胞分布，为进一步研究GPR107的功能及作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

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细胞系与载体 人胚胎肾细胞系293T细胞在该实验室保存；真核细胞表达载体pCMV-Tag-2B购自美国Promega公司；克隆载体pMD-18T购自大连宝生物有限公司；自人cDNA文库中获得GPR107 cDNA的质粒(克隆号：23329)由厦门大学韩家淮教授惠赠。

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引物 根据韩家淮教授实验室提供人GPR107基因的mRNA序列，利用Primer-BLAST在线软件进行引物设计。根据真核表达载体pCMV-Tag 2B多克隆位点的限制性核酸内切酶，在上游和下游引物的5′端分别引入限制性核酸内切酶BamH I和Hind III的识别序列及其保护碱基。使用的引物序列为：上游引物P1，5′-CGCGGATCCGCGATGGCCGCTCTGGCGC-3′(红色表示BamH I识别位点)；下游引物P2，5′-CCCAAGCTTGGGCACGGCGCCTTCCCAC-3′(红色表示Hind Ⅲ识别位点)。引物由上海生物工程有限公司合成。

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主要试剂 DMEM高糖培养基、青霉素和链霉素双抗混合液、磷酸盐缓冲液(PBS)均购自美国Hyclone公司；……