刘曹彤 陆依琳 徐慧 彭学

摘要：对羟基苯甲酸（4-Hydroxybenzoate，4HBA）应用广泛，在工业领域上被当作前体合成各种芳香族化合物，其中包括液晶材料、农药等;在食品和化妆品等领域上被当作防腐剂。微泡菌属（Microbulbifer sp.） A4B-17是一种能将葡萄糖合成4HBA的海洋细菌，为了提高4HBA的合成效率对合成莽草酸途径前体的2个关键酶：GM004356编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）和GM0031333编码的烯醇化酶（Enolase）进行研究。通过构建蛋白系统进化树发现，PEPCK与Microbulbifer sp. GL-2的PEPCK相似度为95.15%，Enolase与Microbulbifer variabilis的Enolase相似度为98.13%。利用低温表达载体在大肠杆菌中对2个酶进行高效表达，提取和纯化后，采用BCA法蛋白定量计算后得到纯化后的PEPCK和Enolase分别占各自粗酶液的1.304%和1.123%。酶活采用PK/LDH（丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶）偶联检测法检测NADPH的减少量。根据米氏常数双倒数法求得PEPCK和Enolase的Km值分别为0.041 mmol/L和0.056 mmol/L，PEPCK反应的最适温度为30 ℃，最适pH值为7，Enolase的最适温度为 30 ℃，最适pH值为7。以上结果为高效生产4HBA提供了理论依据。

关键词：对羟基苯甲酸;磷酸烯醇式丙酮酸;烯醇化酶;磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶

中图分类号：S188+.3 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2021）12-0045-06

收稿日期：2020-11-04

基金项目：江苏师范大学科研创新计划校立项目（编号：2020XKT485）。

作者简介：刘曹彤（1996—），女，江苏淮安人，硕士研究生，主要从事环境微生物学研究。E-mail：3220859786@qq.com。

通信作者：彭学，博士，教授，主要从事环境微生物学研究。E-mail：pengxue@jsnu.edu.cn。

对羟基苯甲酸（4-Hydroxybenzoate，4HBA）及其酯类物质，不仅能抑制真菌和细菌的生长，还能调节一些酶的代谢，应用非常广泛[1]，覆蓋了衣食住行各个方面，比如用于食品与化妆品的防腐剂、农业中的杀菌剂与化肥、手机电脑等的液晶制品等方面[2-6]。……