刘曹彤 陆依琳 徐慧 彭学

摘要：对羟基苯甲酸（4-Hydroxybenzoate，4HBA）应用广泛，在工业领域上被当作前体合成各种芳香族化合物，其中包括液晶材料、农药等;在食品和化妆品等领域上被当作防腐剂。微泡菌属（Microbulbifer sp.） A4B-17是一种能将葡萄糖合成4HBA的海洋细菌，为了提高4HBA的合成效率对合成莽草酸途径前体的2个关键酶：GM004356编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）和GM0031333编码的烯醇化酶（Enolase）进行研究。通过构建蛋白系统进化树发现，PEPCK与Microbulbifer sp. GL-2的PEPCK相似度为95.15%，Enolase与Microbulbifer variabilis的Enolase相似度为98.13%。利用低温表达载体在大肠杆菌中对2个酶进行高效表达，提取和纯化后，采用BCA法蛋白定量计算后得到纯化后的PEPCK和Enolase分别占各自粗酶液的1.304%和1.123%。酶活采用PK/LDH（丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶）偶联检测法检测NADPH的减少量。根据米氏常数双倒数法求得PEPCK和Enolase的Km值分别为0.041 mmol/L和0.056 mmol/L，PEPCK反应的最适温度为30 ℃，最适pH值为7，Enolase的最适温度为 30 ℃，最适pH值为7。以上结果为高效生产4HBA提供了理论依据。

关键词：对羟基苯甲酸;磷酸烯醇式丙酮酸;烯醇化酶;磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶

中图分类号：S188+.3 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2021）12-0045-06

收稿日期：2020-11-04

基金项目：江苏师范大学科研创新计划校立项目（编号：2020XKT485）。

作者简介：刘曹彤（1996—），女，江苏淮安人，硕士研究生，主要从事环境微生物学研究。E-mail：3220859786@qq.com。

通信作者：彭学，博士，教授，主要从事环境微生物学研究。E-mail：pengxue@jsnu.edu.cn。

对羟基苯甲酸（4-Hydroxybenzoate，4HBA）及其酯类物质，不仅能抑制真菌和细菌的生长，还能调节一些酶的代谢，应用非常广泛[1]，覆蓋了衣食住行各个方面，比如用于食品与化妆品的防腐剂、农业中的杀菌剂与化肥、手机电脑等的液晶制品等方面[2-6]。4HBA的毒性较低，抑菌效果也好，所以在2002年，对羟基苯甲酸酯类物质已经被我国批准作为食品防腐剂添加使用[7]。

目前大部分4HBA通过石油分馏[8]得到，也有报道利用植物[9]或者重组大肠杆菌[10]合成4HBA，但是这些方法存在很多的缺陷，植物合成得到的4HBA提纯难度大[11]。微泡菌属（Microbulbifer sp.） A4B-17菌株是能将葡萄糖合成4HBA及其酯类的海洋细菌，笔者所在课题组已经完成了A4B-17菌株的基因组测序和注释[12]。合成4HBA的途径有2条：葡萄糖降解途径和莽草酸途径，在后者途径中磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和4-磷酸赤藓糖缩合反应生成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶（DAHP），PEP的合成量较低成为莽草酸途径的限速步骤。A4B-17菌株合成PEP的途径有2条：2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸途径（ED途径）和糖酵解途径（EMP途径）。在ED途径中，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）将草酰乙酸（OAA）脱羧生成PEP;在EMP途径中烯醇化酶（Enolase）将2-磷酸甘油酸（OAA）脱水生成PEP。EMP途径和ED途径[13]的共同点是将合成PEP作为通路的最后一步反应。同时在之后的合成途径中，PEP作为起始物质，4HBA及其酯类合成多少完全取决于它的积累量[14]。可以说要想大量合成4HBA及其酯类，就需要大量合成PEP。A4B-17菌株的PEPCK和Enolase这2个酶分别由编号为GM004356和GM001333的基因编码，而且在该细菌体内，有且只有这2种酶能够合成PEP，因此对这2个基因编码的蛋白酶的研究是非常有必要的。对这2个酶的研究不仅能了解它们的理化性质，还能够为提高PEP的产量提供理论基础，从而为提高4HBA的产量打下基础[15]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

Microbulbifer sp. A4B-17菌株（由笔者所在课题组从海水中分离得到，并保存于江苏师范大学生命科学学院）;大肠杆菌DH5α（笔者所在实验室长期保存于 -80 ℃ 超低温冰箱中）;pET-21a（+）载体（购买自武汉淼灵生物科技有限公司）。

1.2 试验试剂

Q5 High-Fidelity DNA Polymerase，5×Q5 High GC Enhancer（optional），5×Q5 Reaction Buffer，dNTP Mix，dd Water，LB肉汤，100 mg/mL Ampicillin（Amp）母液，50×TAE Buffer（pH值8.5），1%琼脂糖凝胶，DNA marker，DNA loading buffer，GoldView核酸染料，质粒提取相关试剂[16]，磷酸缓冲液PBS母液（0.2 mol/L），0.1 mol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），30% （质量浓度）丙烯酰胺溶液（Acr-Bis），10%（质量浓度）过硫酸铵，5×Tris-Glycine Buffer（电泳缓冲液），1 mol/L Tris-HCl（pH值为6.8），1.5 mol/L Tris-HCl（pH值为8.8），10% SDS考马斯亮蓝R-250染色液，考马斯亮蓝脱色液，5×SDS-PAGE loading Buffer，β-巯基乙醇（β-ME），蛋白纯化试剂盒等。

1.3 GM004356和GM001333编码基因的克隆与鉴定

1.3.1 目的片段的扩增

首先分别设计GM004356和GM001333这2个目的基因的引物，引物设计见表1，引物序列交由上海捷瑞生物工程有限公司合成。设计PCR反应体系，加入PCR管中，混匀，放入PCR仪，设置好反应条件，运行程序。35次循环。

1.3.2 载体酶切

选择pET-21a（+）载体，大小为5 443 bp，酶切位点为BamHⅠ和XhoⅠ，采用双酶切，载体酶切后，需要将目的基因与载体进行连接，形成重组质粒。选择的酶连试剂盒为Ready-to-Use Seamless Cloning Kit。总反应体系为 50 μL，混合均匀后于37 ℃水浴5 min。

1.3.3 阳性转化子质粒提取

将重组质粒转入大肠杆菌，培养结束后，挑取部分单菌落进行液体培养，然后利用十二烷基硫酸钠（SDS）碱裂法提取质粒。

1.3.4 阳性转化子酶切鉴定

将酶切体系加到PCR管中，混合均匀，放入37 ℃水浴锅中孵育5～10 min，然后琼脂糖凝胶电泳验证结果。

1.4 PEPCK和Enolase的表达与酶活探究

1.4.1 粗酶提取

将活化好的菌落接入含氨苄青霉素（Amp）的LB三角瓶中，37 ℃，180 r/min，培养至吸光度为0.4～0.6，再加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）低温低速诱导培养12～24 h，使目的蛋白充分表達。将培养好的菌液5 000 r/min，低温离心10 min，弃上清，用pH值为7.4的PBS缓冲液（磷酸缓冲盐溶液）重悬细胞，再离心，再重悬，用超声波破碎仪破碎细胞，4 ℃ 离心，上清即为粗酶混合液。

1.4.2 蛋白纯化

提取出的粗酶中，绝大部分是不需要的杂蛋白，想要研究目的蛋白的性质，需要将目的蛋白提取出来，选择蛋白纯化试剂盒进行纯化。为了给后续试验提供一个定量结果，需要计算出粗酶中PEPCK和Enolase的含量。采用BCA（聚氰基丙烯酸正丁酯）蛋白定量法，根据吸光度与蛋白浓度成正比，绘制蛋白浓度标准曲线，从而能够计算出目的蛋白占粗酶的百分比。

1.4.3 PEPCK和Enolase酶活检测方法

PEPCK和Enolase酶活检测方法采用PK（丙酮酸激酶）/LDH（乳酸脱氢酶）偶联检测法，即将不方便检测的磷酸烯醇式丙酮酸，经PK和LDH催化后，生成丙酮酸，然后与还原型辅酶Ⅱ（NADPH）反应生成NADP+，而NADPH容易被检测，NADPH浓度的减少量与PEPCK和Enolase的活性成正相关，通过测定在340 nm处NADPH吸光度的减少，来反映酶的活性。

根据PK/LDH偶联检测法探究2个酶的最适温度和最适pH值。研究PEPCK的最适温度，要控制pH值、反应时间、调控剂不变。设置不同反应温度，固定pH值不变;研究PEPCK最适pH值时，要控制温度、反应时间、调控剂不变，各反应成分与研究最适温度时一致，只是改变缓冲液的pH值不同。用同样的方法来探究Enolase的最适温度和最适pH值。

2 结果与分析

2.1 系统进化树分析

在Microbulbifer sp. A4B-17菌株中找到编号为GM004356和GM001333的全部碱基序列，经NCBI数据库比对分析，确定这2个基因分别编码PEPCK和Enolase。GM004356编码的PEPCK与Microbulbifer sp. GL-2、Microbulbifer sp. THAF38和Microbulbifer variabilis编码的PEPCK相似度较高，相似度都为95.15%，系统进化树见图1。GL-2菌株分离自硬骨鱼肠道中[17]，是一个新的降解纤维素的菌株。Microbulbifer variabilis分离自太平洋海藻，能够产生抗癌吩嗪抗生素[18]。关于THAF38菌株还没有相关报道。GM001333编码的Enolase与Microbulbifer variabilis和Microbulbifer sp. THAF38的Enolase相似度较高，相似度都为98.13%，系统进化树见图2。

2.2 高效表达质粒的构建

2个目的基因GM004356和GM001333分别进行PCR，琼脂糖凝胶成像分析（图3）。选用pET-21a（+）载体，采用双酶切，与目的基因相连，构成重组质粒，导入大肠杆菌体内。通过验证，获得阳性转化子，并测序，与原始目的基因比对，发现重组质粒中的目的基因未发生突变或缺失，与原始基因完全一致，可以利用该菌落进行后续的蛋白研究。

2.3 蛋白质的提取和纯化

低温低速诱导目的蛋白表达，提取粗酶，电泳初步判断转入大肠杆菌的目的基因成功表达，接着对粗酶进行纯化，电泳验证纯化结果，发现目的蛋白PEPCK和Enolase均能被纯化，且效果明显，可以进行后续的定性分析，具体结果见图4和图5。

将粗酶液稀释10倍后用BCA法测得样品吸光度为2.526 4，通过标准曲线， 计算出粗酶液中蛋白总浓度为3.298 mg/mL。纯化之后目的蛋白PEPCK吸光度为0.337，根据标准曲线，计算出纯化后的PEPCK浓度为0.043 mg/mL，占粗酶液的1.304%。同样的方法，得到Enolase占粗酶液的1.123%。

2.4 PEPCK和Enolase米式常数的研究

米氏常数（Km）定义为当酶促反应达最大速度（vm）一半时底物（S）的浓度。对Km的研究，能揭示其在参加反应时的重要性质，为该酶应用到工业生产中提供重要的理论依据。根据米氏常数双倒数求法的计算公式：1/v=Km/（vmax[S]）+1/vmax，可以看成y=ax+b的形式，需要做出初始反应速率的倒数，以及反应底物浓度的倒数，设定反应时间为 2 min，底物浓度足够大。因为当y=0时，横截距即为-1/Km，得到PEPCK的Km值为0.041 mmol/L，如图6-A所示。Enolase的Km值为0.056 mmol/L，如图6-B所示。2个Km值都较低，说明PEPCK与OAA，Enolase与底物2-磷酸甘油（PGA）的酶促反应很容易进行，从而转化生产磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），因此更有利于重要中间产物PEP在菌体中的积累。

2.5 最适温度和最适pH值

探究PEPCK的最适温度，设置不同反应温度，固定pH值保持不变，反应结束后测定NADPH的吸光度，结果见图7，发现在30 ℃左右时，PEPCK活性最高。探究最适pH值时，设置不同pH值，保持温度为30 ℃，发现pH值为7时酶活最高（图8）。

同样的方法，分别设置Enolase的反应温度和缓冲液pH值，发现Enolase的最适反应温度为30 ℃，最适pH值为7，结果如图9和图10所示。

3 讨论与结论

Microbulbifer sp. A4B-17菌株的特点是本身就可以合成对羟基苯甲酸及其酯类，而且产量较高，不会产生对人体有毒有害的物质。本研究对细菌细胞内编号为GM004356和GM001333的2个目的基因进行转化克隆，高效表达PEPCK和Enolase，通过提取纯化计算出纯化之后目的蛋白PEPCK占粗酶液的1.304%，纯化后的Enolase占粗酶液的1.123%。PEPCK酶反应的最适温度为30 ℃。最适pH值为7;Enolase的最适温度为30 ℃，最适pH值为7。PEPCK和Enolase的米氏常数分别是0.041、0.056 mmol/L，较低的Km值更有利于酶促反应的快速进行。通过蛋白系统进化树分析，PEPCK与Microbulbifer sp. GL-2的PEPCK相似度为95.15%;Enolase与Microbulbifer variabilis的Enolase相似度为98.13%。本研究对PEPCK和Enolase 2种酶进行深入研究，为将来2个酶的优化研究建立标准。笔者所在课题组期望通过对该菌株的深入研究，改变传统的生产方式，利用可再生资源合成4HBA等工业原料。

本试验所采用的酶活性研究方法均为PK/LDH酶偶联法，该方法虽操作简单，思路清晰，但是在偶联法中，PK以及LDH的活性会对整个试验结果产生较大影响，而且最终得到的米氏常数其实是目的蛋白酶与PK、LDH共同作用的结果。目前对PEP的检测暂无有效可行的方法，开辟一种新的检测方法还需要大量工作，后续可以在本研究的基础上进行拓展研究。

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