牟娟 李健田 毛子春

摘要：目的 创建应用HPLC法对“补气养血合剂” 中含有的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1（后文称“4种皂苷”）进行含量测定的方法。方法 采用HPLC法。色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（长度：250 mm，直径：4.6 mm，孔径：5μm），P.N.959990—902。柱温：30℃。流速：1.0 mL/min。检测波长：203nm。进样量：10μL。流动相：水（A）—乙腈（B），程序洗脱。结果 三七皂苷R1：线性关系在0.0829—2.0454μg范围内良好（R=0.9995）。平均加样回收率为：95.17%（RSD为0.65%，n为6）。人参皂苷Rg1：线性关系在0.2944—5.1263μg范围内良好（R=0.9999）。平均加样回收率为：96.81%（RSD为1.17%，n为6）。人参皂苷Rf：线性关系在0.0039—0.0586μg范围内良好（R=0.9993）。平均加样回收率为：104.05%（RSD为1.78%，n为6）。人参皂苷Rb1：线性关系在0.2350—3.5256μg范围内良好（R=0.9999）。平均加样回收率为：96.61%（RSD为1.33%，n为6）。结论 创建了应用HPLC法对“补气养血合剂”中含有的4种皂苷进行含量测定的可信度较高的方法。

关键词：三七皂苷R1;含量测定;人参皂苷Rg1;人参皂苷Rf;补气养血合剂;人参皂苷Rb1;HPLC法

中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2021）05-0073-05

“补气养血合剂”系医院多年使用协定处方，临床效果显著。方中使用了“三七”、“人参”两味药材;具有“活血益气，补肝肾”等功效。《中国药典》（2015年版）一部收载的“三七”药材，载有“散瘀止血，消肿止痛”等功效;“人参”载有“生津养血”等功效[1]。“补气养血合剂”目前在标准制订研究阶段，使用HPLC法对补气养血合剂中人参、三七含有的4种皂苷进行含量测定。对“补气养血合剂”作进质量控制。对色谱条件、提取方法等进行考察，来确保实验方法的可靠性、准确性。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪（四元泵，DAD检测器，自动进样器），Agilent1260化学工作站;万分之一分析天平（赛多利斯BP211D-OCE）。

1.2 试药 补气养血合剂（医院自制）;人参皂苷Rg1对照品（批号：110703-201128，中国食品药品检定研究院，含量以91.1%计）;人参皂苷Rf标准品（批号：110719-201505，中国食品药品检定研究院）;人参皂苷Rb1标准品（批号：110704-201726，中国食品药品检定研究院，含量以92.4%计）三七皂苷R1标准品（批号：110745-201128318，中国食品药品检定研究院，含量以94.0%计）;乙腈、甲醇（色谱纯）;其他化学试剂为分析纯;水为超纯水。

2 方法条件选择与结果

2.1 检测波长的确定 需要检测的补气养血合剂中含有的这4种皂苷主要来自处方中的三七和人参，本实验方法的检测波长确定为203nm。是参考《中国药典》（2015年版）一部収载的用HPLC法测定“三七”、“人参”中这4种皂苷的含量的方法。

2.2 色谱条件的确定

2.2.1 流动相 本次实验首先参考《参考《中国药典》（2015年版）一部収载的“三七”、“人参”标准中含量测定时的流动相。开展后对梯度洗脱的流动相比例以及比例转化时间进行了一系列的探索[11]，最终筛选出适合此次实验的如“表1”所示的梯度洗脱程序。使用其他条件洗脱程序，出現样品中目标物质的吸收峰均分不开，有相邻的吸收峰合并等问题。

2.2.2 柱温 设置25、27、30℃进行筛选[10]，25、27℃目标物质的分离度小于1.5。柱温为30℃时，分离度才达到要求，柱温确定30℃。

2.2.3 色谱柱 多次实验确定使用ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色谱柱，分离效果好达到要求。

3 溶液的配制

3.1 样品溶液的准备 使用不同的溶剂如三氯甲烷、乙醚、水饱和的正丁醇等提取，采取大孔树脂柱、氨试液等方法洗脱杂质。进行实验反复对比、优化最终确认样品制备方法如下。

精密量取样品10 mL，用三氯甲烷萃取3次，每次10 mL，弃去三氯甲烷液。再用水饱和的正丁醇萃取3次，每次20 mL;合并水饱和的正丁醇液，再用氨试液60 mL萃取，弃去氨试液;再取适量水饱和的正丁醇来洗涤分液漏斗，收集洗涤液。合并水饱和的正丁醇液于蒸发皿中，在水浴锅上蒸干。残渣用甲醇溶解至10 mL容量瓶，甲醇定容至刻度、摇匀、滤过，取续滤液，即得。

3.2 标准品溶液的准备 分别精密称取一定质量4种皂苷的标准品，加甲醇使其溶解于适当的容量瓶。再用甲醇定容至刻度，制成一定浓度的“单一成分标准品溶液”。精密量取一定体积上述“单一成分标准品溶液”于同一适当的容量瓶，甲醇定容至刻度。作为“混合标准品溶液”。。

3.3 阴性对照溶液的准备 根据“补气养血合剂”的处方。只去除“三七”、“人参”药材。其他的条件不变。按“补气养血合剂”的制作方法制作。制成“缺三七和人参的补气养血合剂”。按“3.1”项制备，来作为阴性对照溶液。

4 色谱条件及系统适应性

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（长度：  [LL]250 mm，直径：4.6 mm，孔径：5μm），P.N.959990—902。柱温：30℃。流速：1.0 mL/min。检测波长：203nm。进样量：10μL。流动相：水（A）—乙腈（B）。按“表1”中程序进行梯度洗脱。三七皂苷R1的保留时间为32.75 min。人参皂苷Rg1的保留时间为44.91 min。人参皂苷Rf的保留时间为69.85 min。人参皂苷Rb1的保留时间为87.41 min。分离度均大于1.5。缺三七、缺人参的补气养血合剂作为阴性对照。在32.75、44.91、69.85、87.41 min处无吸收峰干扰。如“图1”所示。

5 方法学研究

5.1 专属性考察 按照上述色谱条件，分别取3.1、3.2、3.3项下溶液进样，采集色谱图（见图1），由图可知，阴性对照色谱（缺三七、人参）在对照品相应出峰位置上处无干扰峰，对测定干扰小，系统误差小;对照品、样品色谱图（Rt=32.75、44.91、69.85、87.41 min）分离效果良好，本实验方法专属性强。

Ⅰ：4种皂苷的混合对照.Ⅱ：补气养血合剂样品.Ⅲ：缺三七和人参的补气养血合剂.

5.2 线性关系考察 用 上述确定的色谱条件。测定不同浓度的混合对照品。以三七皂苷R1标准品的含量作为横坐标，对应峰面积为纵坐标。绘制标准曲线[8-10]。结果如“表2”、“图2”所示。以人参皂苷Rg1标准品的含量作为横坐标，其对应峰面积为纵坐标。绘制标准曲线。结果如“表3”、“图3”所示。以人参皂苷Rf标准品的含量作为横坐标，其对应峰面积为纵坐标。绘制标准曲线。结果如“表4”、“图4”所示。以人参皂苷Rb1标准品的含量作为横坐标，其对应峰面积为纵坐标。绘制标准曲线。结果如“表5”、“图5”所示。回归方程为：三七皂苷R1：y=407.18x-3.6129，线性关系在0.0829—2.0454μg范围内良好（R=0.9995）。人参皂苷Rg1：y=504.32x+31.652，线性关系在0.2944—5.1263μg范围内良好（R=0.9999）。人参皂苷Rf：y=498.04x+1.4303，线性关系在0.0039—0.0586μg范围内良好（R=0.9993）。人参皂苷Rb1：y=429x+0.1306，线性关系在0.2350—3.5256μg范围内良好（R=0.9999）。

5.3 稳定性考察 用准备好的同一样品溶液，用上述的色谱条件。分别在0、2、4、8、24h进样。来测定样品中含有的4种皂苷的峰面积。计算4种皂苷峰面积的RSD如“表6”所示。依次为：三七皂苷R1为1.44%。人参皂苷Rg1为0.49%。人参皂苷Rf为1.53%。人参皂苷Rb1为0.69%。说明了样品溶液在24h内比较稳定。

5.4 精密度试验 用“混合对照品溶液”。按上述的色谱条件。测定4种皂苷的吸收峰面积。连续测定6次。然后计算4种皂苷的峰面积RSD如“表7”所示。依次为：三七皂苷R1为0.86%。人参皂苷Rg1为0.57%。人参皂苷Rf为1.41%。人参皂苷Rb1为0.62%。说明了使用“2.1”的色谱条件。该仪器的精密度比较良好。

5.5 重复性考察 用准备好的同一批次的6份样品溶液，用上述的色谱条件。检测4种皂苷的峰面积。计算他们的平均含量及RSD值如“表8”所示。结果依次为：三七皂苷：含量=0.0847 mg/mL，RSD=1.45%。人参皂苷Rg1：含量=0.3246 mg/mL，RSD=0.98%。人参皂苷Rf：含量=0.0033 mg/mL，RSD=1.49%。人参皂苷Rb1：含量=0.3087 mg/mL，RSD=0.97%。说明此次实验的方法具有比较良好的重复性。

5.6 加样回收率考察 精密量取5 mL已知含量的样品于分液漏斗中。再精密量取适量的“混合标准品溶液”加入其中。按“3.1”样品溶液的准备方法，准备6份溶液。作为加样回收试验的溶液。用上述的色谱条件。进行吸收峰面积的检测。然后计算平均加样回收率如“表9”、“表10”、“表11”、“表12”所示。

5.7 供试品含量测定 用3个批次的样品按“3.1”样品溶液的准备方法，各准备2份样品溶液。采用上述的色谱条件。对样品中含有的4种皂苷峰面积进行了2次检测。然后计算出他们的平均含量如“表13”所示。

6 结论

本试验采用DAD UV HPLC色谱法测定样品中 三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1的含量，本检验方法得到的标准工作曲线相关系数为0.9999，精密度的RSD值小于1.5%，重复性的RSD值0.4%，加标回收率在95.0%～105.0%间。该方法适用“补气养血合剂”中含有4种皂苷的含量测定。可信度较高，对“补气养血合剂”的标准起草及质量控制有着重要的意义。

7 讨论

對处方中同时调配三七和人参2味中药情况，无论是在制剂还是临床方剂中不多见。在常见的质量标准中三七含量测定成分为人参皂甙Rb1、Rg1、三七皂甙R1三者总和，三七皂甙R1为三七鉴别的专属性指标成分;人参含量测定成分为人参皂甙Rg1、Rb1、Re三者总和，人参皂甙Rf为人参鉴别的专属性指标成分。本次实验研究在选取含量测定控制指标性成分时选定三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rf 四个对照物质进行控制，便于对处方中的三七和人参质量控制。但因在同一方法中控制指标多，在样品分离度、重现性、稳定性等方面要求高、难度较大;对检测设备的性能要求较高。

对样品提取环节也有要求，皂苷类物质在溶液中稳定性不高容易发生分解。在质量标准研究阶段可以通过精细控制达到不同批次样品差异性不大。但在中试及大生产过程中不易控制，须在药品研发生产工艺时总体控制调节：如调节溶液pH值、在提取环节进一步纯化中间品等，进一步改善药品的稳定性。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中国人民共和国药典[S].1部.中国医药科技出版社.

[2]刘颖.应用HPLC法对参乌合剂中人参皂苷Rb1、Rg1含量测定的研究[J].中国处方药，2018，12（16）：33-34.

[3]潘俊杰，郑琴，阳明.三七中三七总皂苷的提取、分离纯化及分析方法的研究进展[J].世界科学技术-中医药现代化，2007.9（6）：77-82.

[4]刘凤艳，张二勇，周波，等.皂苷提取分离新技术研究进展[J].辽宁化工，2009，38（1）：60-61.

[5]蔡芷辰，周艳丽，李振麟，等.HPLC法同时测定9个不同产区人参花中5种皂苷含量[J].中医药导报，2019，25（2）：86-88.

[6]韩利平，高家荣，李静雯，等.HPLC法同时测定黄安消胶囊中4种化学成分的含量[J].中医药临床杂志，2018，30（3）：475-478.

[7]艾强，雷阳，张厚才，等.HPLC法测定三七总皂苷含量[J].现代农业科技，2016（14）：274-275.

[8]田蜜，陈芳，贺健昌.HPLC法测定黄七化瘀丸中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1的含量[J].吉林中医药，2018，38（11）：1319-1322.

[9]焦传新，袁武，黄任嵩，等.人参花中人参皂苷Re和Rg1成分提取工艺优选[J].亚太传统医药，2019，15（1）：60-62.

[10]朱连连，栾晓宁，窦德强.黑参中人参皂苷Rg3、的含量测定[J].中国现代中药，2019（3）：323-327.

[11]刘梦楠，薛雪，熊慧，等.不同净制工艺对三七质量的影响[J].世界中医药，2019，14（2）：297-300.