汪新芳 马 滕

山东省枣庄市中医医院 北京中医药大学枣庄医院眼科，山东枣庄 277000

青光眼是一种因视神经退行性病变所致视功能 损害的疾病，其发病机制至今不明，其主要特征为急性高眼压[1-3]。视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）凋亡与坏死是导致青光眼视神经损害的主要原因，保护青光眼视神经的关键环节是保护RGCs[4-5]。雷公藤甲素是从我国传统中药雷公藤中提取的主要有效成分之一，其主要药理活性为抗炎和免疫抑制[6-7]。文献报道[8]，雷公藤甲素能够抑制中枢神经系统小胶质细胞活化，但其用于急性青光眼的有关报道目前较为少见。因此本研究建立急性高眼压大鼠模型，采用雷公藤甲素干预后观察实验动物的RGCs 情况，探讨雷公藤甲素治疗青光眼的潜在可能性。

1 材料与方法

1.1 试剂与设备

雷公藤甲素（中国药品生物制品检定所）；TUNEL原位凋亡试剂盒（瑞士罗氏公司，批号：116848）；免疫荧光染色试剂盒（北京爱必信公司，批号：abs50013）；兔抗大鼠Caspase-3 抗体（美国Bioworld 公司，批号：CJ44121）；XDS-1B 型倒置显微镜（重庆光学仪器厂）；石蜡组织切片机（德国LEICA 公司，RM2235）；图像采集系统（德国莱卡公司，DM5500 B）。

1.2 实验动物及分组

健康清洁级成年Wister 大鼠60 只，雌雄各半，体重（200±20）g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物许可证号SCXK（京）2017-0016。实验动物适应性饲养7 d 后，进行正式实验。本实验经北京中医药大学实验动物伦理委员会批准。

采用随机数字表法将60 只大鼠分为对照组、模型组、雷公藤甲素组，每组20 只。对照组不做任何处理，模型组和雷公藤甲素组大鼠右眼均制备急性高眼压模型。造模后雷公藤甲素组每日腹腔注射10 μg/kg雷公藤甲素，对照组和模型组注射等量的生理盐水，共注射7 d。

1.3 动物模型的建立

以戊巴比妥钠麻醉动物，依据参考文献[9]方法，于结膜囊内滴丁卡因眼药水眼表麻醉5 min，5 号静脉输液针头前房穿刺，然后升高输液瓶，调节输液器高度以控制压力（110 mmHg）（1 mmHg=0.133 kPa），维持1 h，缓慢降低输液瓶高度与动物水平，测量眼压，>22 mmHg 即为急性高眼压损伤建模成功。

1.4 取材及标本制备

连续药物腹腔注射7 d 后，将大鼠麻醉处死，快速摘取右眼眼球，留取部分球后视神经组织，4%多聚甲醛中固定24 h，石蜡包埋，用于后续HE、TUNEL 法、免疫荧光染色观察。

1.5 HE 染色观察三组视网膜改变

将视网膜置于4%多聚甲醛中固定，石蜡浸蜡，常规包埋，4 μm 连续矢状切片，常规HE 染色[10]，显微镜观察。采用Image Pro Plus 5.1 软件测量视网膜神经纤维层（retinal nerve fiber layer，RNFL）厚度。

1.6 TUNEL 法染色观察RGCs 凋亡情况

将“1.4”中石蜡包埋组织切片常规脱腊，参照TUNEL 试剂盒说明书操作，玻片干后，用抗荧光衰减封片剂封片，风干，荧光显微镜下观察并拍照[11]。观察各组RGCs 的凋亡情况。

1.7 免疫荧光法观察存活RGCs

依据参考文献[12]，将视网膜置于4%多聚甲醛中固定1 h，PBST 漂洗3 次，驴血清封闭1 h 后加入βⅢTubulin 一抗（1∶100），4℃孵育过夜，PBS 漂洗3 次，每次10 min，加入相应Cy3（1∶100）二抗，于室温下避光孵育2 h，PBS 漂洗后封片，荧光显微镜下观察，参考文献[4]的方法，计算存活RGCs 数。

1.8 免疫组化检测三组视网膜中Caspase-3 表达

制备的石蜡切片常规脱蜡，水浴加热修复，滴加H2O2溶液使内源性过氧化物酶失活，每片滴加Caspase-3（1∶100）一抗，4℃过夜，滴加生物素标记的羊抗兔IgG二抗（1∶100），置于37℃孵育30 min，二氨基联苯胺显色，苏木精复染。Caspase-3 阳性表达为细胞核呈棕黄色，光学显微镜下对阳性细胞进行计数。

1.9 统计学方法

采用SPSS 20.0 对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE 染色观察视网膜病理学改变

对照组视网膜各层次排列规整，RGCs 排列紧密，细胞核边界清楚，呈卵圆形或圆形；模型组视网膜全层、神经纤维层和内外颗粒层均增厚、RGCs 减少，视网膜萎缩；雷公藤甲素组视网膜各层次清晰，排列整齐。见图1。

图1 三组视网膜组织病理学改变（HE 染色，200×）

2.2 三组RNFL 厚度值变化

对照组、模型组和雷公藤甲素组的RNEL 平均厚度分别为：（33.42±1.53）μm、（58.14±1.71）μm、（50.23±2.35）μm。三组RNFL 比较，差异有统计学意义（F=886.417，P ＜0.05）。模型组RNEL 厚度值高于对照组，雷公藤甲素组RNEL 厚度值低于模型组，差异有统计学意义（t=41.224、13.191，均P ＜0.05）。

2.3 三组RGCs 凋亡情况比较

TUNEL 法染色观察到凋亡RGCs 染色呈绿色荧光，见图2。对照组、模型组和雷公藤甲素组凋亡RGCs数分别为：（7.02±2.80）个/视野、（28.50±6.85）个/视野、（14.35±2.69）个/视野。三组凋亡RGCs 数比较，差异有统计学意义（F=115.380，P ＜0.05）。模型组凋亡RGCs 数高于对照组，雷公藤甲素组凋亡RGCs数低于模型组，差异有统计学意义（t=14.942、9.843均P ＜0.05）。

图2 三组视网膜神经节细胞凋亡情况（TUNEL 法染色，200×）

2.4 三组RGCs 存活情况

免疫荧光观察发现，对照组和雷公藤甲素组RGCs 及神经纤维排列整齐；模型组RGCs 及神经纤维排列混乱，见图3。对照组、模型组和雷公藤甲素组存活RGCs 数分别为：（2310.20±152.30）个/0.235 mm2、（1351.50±96.61）个/0.235 mm2、（1644.43±72.67）个/0.235 mm2。三组存活RGCs 数比较，差异有统计学意义（F=383.014，P ＜0.05）。模型组存活RGCs 数少于对照组，雷公藤甲素组存活RGCs 数高于模型组，差异有统计学意义（t=27.005、8.251，均P ＜0.05）。

图3 三组视网膜神经节细胞存活情况（免疫荧光染色，200×）

2.5 三组Caspase-3 阳性细胞数比较

免疫组化法观察发现，Caspase-3 阳性表达为细胞核呈棕黄色。见图4（封四）。对照组、模型组、雷公藤甲素组Caspase-3 阳性细胞计数分别为（1.3±0.2）个/视野、（29.7±4.6）个/视野、（10.1±2.3）个/视野。三组Caspase-3 阳性细胞数比较，差异有统计学意义（F=478.732，P ＜0.05）。模型组Caspase-3 阳性细胞数高于对照组，雷公藤甲素组Caspase-3 阳性细胞数低于模型组，差异有统计学意义（t=30.223、20.858，均P ＜0.05）。

图4 三组Caspase-3阳性细胞数比较(免疫组化染色,200x)

3 讨论

青光眼是全球仅次于白内障的第二大致盲眼病，且青光眼早期不易发现，发现时就已有严重的视神经损害[13]。鼠眼结构与人类类似，具有完备的房角系统，其高眼压模型能够模拟人青光眼视网膜神经损伤的病理过程[14]。雷公藤甲素是中药雷公藤的有效提取成分，具有抗炎、免疫抑制、抗肿瘤等多种药理活性[15-17]。文献报道[18]，雷公藤甲素能减轻蛛网膜下腔出血大鼠皮层的病理改变，减少细胞凋亡，抑制小胶质细胞活化。

本研究发现，与对照组比较，模型组视网膜全层、神经纤维层和内外颗粒层均增厚，RGCs 减少，视网膜萎缩，提示急性高眼压造模成功。雷公藤甲素组与模型组比较，视网膜损伤减轻，RNFL 厚度值降低，提示雷公藤甲素对急性高眼压有防治作用。

研究发现，小胶质细胞在青光眼的视神经损伤过程中扮演重要角色[19]。抑制小胶质细胞过度活化能够有效减轻视网膜神经节细胞损伤，促进视觉功能恢复[20]。还有研究表明[21]，在青光眼视觉传导通路上，神经轴突的损伤状态与小胶质细胞的活化程度完全一致。本研究显示，雷公藤甲素组与模型组比较，凋亡RGCs 数减少，存活RGCs 数升高。这些结果提示雷公藤甲素能促进RGCs 存活，对RGCs 具有保护作用，其机制有待进一步研究，推测雷公藤甲素对小胶质细胞的增生和活化的抑制作用可能是原因之一。

研究报道[22]，RGCs 凋亡与细胞内凋亡相关基因表达有关。Caspase 是一类死亡特异性蛋白酶家族[23]，Caspase-3 是凋亡级联反应的最终效应蛋白，被认为是凋亡的执行器之一，也是青光眼RCGs 死亡过程中重要的细胞信号途径之一[24-25]。本研究中TUNEL及免疫荧光观察结果提示雷公藤甲素可能通过下调Caspase -3 在RGCs 中的表达，减少RGCs 凋亡。

综上所述，雷公藤甲素可能通过抑制Caspase-3表达，增加急性高眼压大鼠模型中RGCs 数量，同时还推测雷公藤甲素可能通过抑制小胶质细胞的增生和活化实现对RGCs 的保护作用，下一步将对其进行深入研究，为青光眼的治疗提供新思路。