兰玉菲 孔 怡唐丽娜 李秀梅

（泰安市农业科学研究院，山东泰安271000）

树舌灵芝（Ganoderma applanatum）隶属于灵芝属（Ganoderma），为我国传统的药用真菌。树舌灵芝性平、味苦，具有调节机体免疫力、抗肿瘤、抑菌消炎等多种功效，且无任何毒性，临床多用于治疗乙型肝炎、食道癌、肺结核、神经衰弱等[1-4]。

2009年以来，笔者从山东省泰安市及其周边地区采集野生树舌灵芝，用组织分离法分离并纯化，3次纯化后获得纯培养，并用分子生物学手段获得ITS序列并构建系统进化树，明确了分类地位，为进一步驯化栽培和育种提供遗传背景清晰的种质资源。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试菌株均由笔者从泰安市、曲阜市等采集的野生树舌灵芝子实体分离纯化所得，保存于泰安市农业科学研究院食用菌研究所。

1.2 主要试剂与仪器

真菌总DNA提取试剂盒（E.Z.N.A.®Fungal DNA Kit）、2×EasyTaq PCR SuperMix等购自北京全式金生物技术有限公司；常规试剂为进口分装或国产分析纯试剂。My Cycle PCR仪，美国伯乐仪器公司。

1.3 培养基

PDA加富培养基：配方参照文献[5]。

1.4 组织分离和培养

参照《植病研究方法》[6]，将采集的野生树舌灵芝子实体生长点表面用70%酒精擦洗后，用解剖刀切取5 mm2组织块，接入PDA加富培养基中，置于25℃黑暗培养。待菌丝萌发后，3次纯化培养获得菌丝纯培养。

1.5 菌丝体制备及DNA的提取

切取PDA加富斜面培养基上保存的5 mm2菌株纯培养，将其接种于PDA加富平板培养基中央，25℃黑暗培养5~7 d，待菌丝长至平板边缘，刮取菌丝体（用于基因组DNA的提取）。

利用DNA提取试剂盒提取真菌总DNA。取200 mg新鲜菌丝体，于液氮中研磨成粉末转移到2 mL离心管中，加入600μL Buffer FG1，混匀后65℃保温10 min，其间轻柔搅动2次；……