王瑞静，钱长敏，田介峰，李瑞明，靳元鹏，罗学军*

（1.天士力控股集团有限公司天士力研究院，天津 300410；2.天士力医药集团股份有限公司创新中药关键技术国家重点实验室，天津 300410）

复方丹参滴丸具有活血化瘀、理气止痛的功效，是临床治疗气滞血瘀所致的心绞痛、冠心病的常用药，广泛用于各类心脑血管疾病［1-2］。其活性成分主要来自于原药材丹参、三七中的酚酸类及皂苷类成分，三七皂苷R1是复方丹参滴丸的主要活性成分之一，为满足复方丹参滴丸国际化申报的质量标准研究、临床样品的检测放行、药效学、药代学等各项研究需求，为此研究三七皂苷R1对照品制备过程，并对其进行赋值及质量研究。

1 仪器和试药

1.1 仪器KDM型电热套；低速大容量多管离心机；R220SE BUCHI旋转蒸发仪；玻璃色谱柱；LC80-600动态轴向加压色谱仪；VT6130真空干燥箱；Agilent 1260高 效 液 相 色 谱 仪；Advance DRX 500 Bruker型核磁共振仪；METTLER XP205电子天平。

1.2 试药 三七饮片（批号201505006，云南天士力三七种植有限公司）；天津海光D101型大孔吸附树脂；D941型大孔吸附树脂；青岛海洋化工柱层析硅胶（100～200目，200～300目）；Dikma色谱纯乙腈；Sigma色谱纯甲醇；水为自制超纯水；其余试剂均为市售分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品候选物的制备 取三七药材，粉碎成粗颗粒，取3 kg，分别加入3个热回流提取器、分别加入6 L 70%乙醇提取两次（2.5 h、2 h），合并提取液，减压浓缩至药材量的1.5倍体积，静置至室温，用低速大容量多管离心机（4 200 r/min，20 min）离心得上清液A。将上清液A加入填装好的D101型大孔树脂色谱柱中（3 kg树脂），依次用水除杂，水洗液弃去，再用30%乙醇洗脱，收集洗脱液，TLC色谱监测流出液，将洗脱液移至旋转蒸发仪中，浓缩至无醇味，得浓缩液B。将浓缩液B加入填装好的D941型大孔吸附树脂色谱柱中。用水冲洗D941大孔树脂色谱柱，收集上样流出液C及水洗脱液，上样流出液C和水洗脱液减压浓缩至干得三醇组总皂苷D 180 g。用硅胶（200～300目）柱层析色谱法分离，用乙酸乙酯-乙醇1∶4为流动相洗脱分离得两部分，一部分是含有人参皂苷Rg1的粗品E，另一部分是含有三七皂苷R1和人参皂苷Re的混合物F，F经动态轴向加压色谱进行精制纯化，制备得高纯度三七皂苷R12.3 g，色谱纯度为100%。

2.2 表征-化合物的结构鉴定

2.2.1 质谱分析 使用ESI源，负离子模式按《中国药典》2015版＜0431＞所规定的方法对经均一化处理试样进行分析，结果显示准分子离子峰m/z:931.526 8[M-H]-（calc.for C47H79O18，931.527 2），以及相关离子峰m/z:977.531 9[M＋HCOO]-，提示该化合物的分子式为C47H80O18。化学结构见图1。

2.2.2核磁共振分析 将经均一化处理试样溶于DMSO-d6中，按《中国药典》2015版＜0441＞所规定的方法进行核磁共振分析。通过对三七皂苷R1的核磁数据分析及相关文献查阅［3］，将三七皂苷R1的13C核磁共振数据进行了归属。见表1。

2.2.3 红外分析 采用KBr压片法按USP 40＜197＞和＜851＞所规定的方法对经均一化处理试样进行红外分析。红外图谱显示在3 300 cm-1附近出现羟基的特征吸收峰；在1 070 cm-1附近出现C-O伸缩振动吸收峰，进一步提示羟基结构的存在；2 900 cm-1附近的吸收峰为C-H伸缩振动吸收峰。支持三七皂苷R1的结构。

2.2.4 紫外分析 将经均一化处理试样溶于甲醇配成稀溶液按USP 40＜197＞和＜851＞所规定的方法进行紫外测试。紫外图谱显示试样在205 nm附近有最大吸收，提示试样结构无发色团。以上信息支持三七皂苷R1的结构。综上，鉴定为三七皂苷R1对照品候选物。

2.3 赋值-质量守恒法计算相对纯度

2.3.1 HPLC法测定色谱纯度

2.3.1.1 色谱条件 色谱柱：Agilent C18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按表2程序进行梯度洗脱；流速：1 ml/min；检测波长203 nm；柱温：30℃。

表2 梯度洗脱程序

2.3.1.2 测定结果 取三七皂苷R1对照品候选物约4 mg，精密称定，用甲醇溶解制成每1 ml含0.4 mg的溶液，精密量取对照品溶液10 μl进样分析。在203 nm下，除主峰外，无杂质峰检出，其归一化法色谱纯度100%，见图2。

图2 三七皂苷R1 HPLC色谱图

2.3.2 水分 将三七皂苷R1对照品候选物按照USP37-NF29＜921＞Ⅰa所规定的Karl-Fischer方法进行水分测定，结果为3.55%。

2.3.3 残留溶剂 将三七皂苷R1对照品候选物按照USP37-NF32＜467＞所规定方法进行溶剂残留分析，结果含乙醇36.4 ppm。

2.3.4 灰分 将三七皂苷R1对照品候选物按照USP37-NF29＜281＞所规定方测定灰分，结果为0.45%。

2.3.5 质量守衡法计算结果 相对纯度=色谱纯度×（1-水分含量-残留溶剂含量-灰分含量）×100%=100%×（1-3.55%-0.003 64%-0.45%）×100%=96.00%。则得三七皂苷R1对照品，相对纯度为96.00%。

3 讨论

三七饮片经提取、D101型大孔树脂富集、D941大孔树脂柱脱色，硅胶柱层析分离、ODS C18色谱精制纯化、其色谱纯度达到99.5%以上，满足对照品候选物的要求［4］。该制备工艺经过后期反复确认，重现性良好。

中药国际申报CMC研究中，缺少对照品成为其不可避免的瓶颈问题，如果对照品是从非监管当局认可来源获得，比如企业自制的对照品，则需要进行充分的研究，包括制备、结构鉴定、标化赋值、包装、稳定性考查等［4-5］。自制对照品具有可溯源性是所有对照品的基本特征，直接与测量的可靠性相关，在对照品的制备过程中要时刻考虑其溯源性、同质性、均匀性和稳定性。