史纪元 姬乐 易智 刘时璋 刘慧通 王雄勋

(1.陕西省人民医院骨科，陕西 西安 710068；2.西安市国际医学中心医院骨科，陕西 西安 710100)

脊髓损伤(SCI)是脊柱损伤中最常见的并发症，常引起严重的中枢神经功能缺损并伴有进行性神经退行性病变，该病致残率高、手术费用高，给患者造成巨大的心理影响和经济负担。尽管针对SCI患者的治疗手段方面已经取得较大的进展，其中包括传统的药物治疗、手术治疗、细胞治疗、基因治疗和组织工程支架，但仍缺乏有效的治疗方法。因此，寻找新的、有效的治疗方法迫在眉睫。MicroRNAs (miRNAs)是一种高度保守的非编码RNA，约有19～25个核苷酸，能够特异性结合靶基因mRNA的3’-UTR，进而抑制或阻断靶基因mRNA的翻译过程。研究发现多种miRNAs参与中枢神经干细胞增殖分化、凋亡和损伤修复，其中miR-301a的异常表达不仅与肿瘤的恶性程度和患者预后有一定的相关性，而且还参与癫痫等神经性疾病的发生。然而，miR-301a-3p在SCI中的作用仍不清楚。分选连接蛋白27(SNX27)参与神经系统疾病的发展和病理过程。已有研究证明，SNX27与阿尔兹海默病、唐氏综合症、小儿肌阵挛性癫痫、脑积水等神经系统疾病相关，但关于miR-301a-3p靶向SNX27并参与SCI后神经功能修复的研究则较少。因此，本研究旨在探讨miR-301a-3p靶向SNX27在SCI后神经细胞凋亡和功能恢复中的调控作用及其潜在机制，为SCI治疗提供新的治疗策略。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 成年雄性Sprague-Dawley大鼠(8周龄，体质量200～220 g)购买于上海实验动物公司。将大鼠置于特定的无病原体屏障系统中恒温7 d，控制条件：温度(23±0.5)℃，相对湿度70±10%，人工12 h明暗循环，自由取水取食。

1.1.2主要试剂 miR-301a-3p模拟物(miR-301a-3p mimic)、miR-301a-3p 抑制物(miR-301a-3p inhibitor)及各自阴性对照(NC mimic和NC inhibitor)，SNX27干扰RNA(SNX27 siRNA)，SNX27过表达载体(Ad-SNX27)均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；HEK-293细胞和未分化的PC12细胞株(上海细胞生物学研究所)；Lipofectamine®2000和Trizol试剂均购于美国Invitrogen公司；TaqMan MicroRNA反转录试剂盒购于美国Thermo Fisher Scientific公司；Takara反转录试剂盒购于大连Takara生物科技公司； SYBR Green PCR Master Mix 均购于美国Applied Biosystems公司；兔抗大鼠SNX 27、Cleaved-caspase 3、NF-200抗体购于大连Takara生物科技公司；兔抗小鼠Bcl-2和Gap-43抗体购于美国Sigma公司；Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒、PBS 缓冲液均购于上海凯基生物。

1.1.3主要仪器 Western blot系统(北京六一仪器厂 DYY-7C)，Bio-Rad 680酶标仪(美国Bio-Rad公司)，台式低温高速离心机(日本KUBOTA公司)，细胞培养箱(上海力申科学仪器公司)，流式细胞仪(Beckman CytoFLEX)。

1.2方法

1.2.1分组及脊髓损伤(SCI)大鼠模型建立 按照Allen背侧打击法建立大鼠脊髓撞击损伤模型：首先对大鼠腹腔注射10%水合氯醛(30 mg/kg)进行麻醉。在小鼠背侧纵行切开以脊柱T10为中心的背部皮肤和皮下组织，暴露硬脊膜，然后将质量为10 g、直径为2 mm的打击砝码从大鼠垂直上方5 cm处自由下落，对大鼠T10节段脊柱进行打击。在砝码撞击于脊髓时，大鼠躯体快速抽动，双下肢迅速回缩及弹动，尾巴痉挛性摆动，大鼠出现暂时性排尿功能障碍。假手术组(Sham)进行了除脊髓打击损伤过程以外的其他所有处理。将大鼠随机分为12组：假手术组(1 d、3 d、7 d、14 d、21 d和28 d)和SCI组(1 d、3 d、7 d、14 d、21 d和28 d)，每组5只。最后，取击打部位的组织进行qPCR分析。所有实验和动物处理均严格按照陕西省人民医院动物伦理委员会的规定进行。

1.2.2PC12细胞培养和H2O2损伤模型的建立 用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养PC12细胞，并置于37℃，5% CO2孵育箱中培养。建立H2O2损伤PC12细胞模型，将浓度为1×105个细胞/孔的PC12细胞接种于6孔培养板中，待培养至第3天后，弃去原培养液，加入含有150 μmol/L H2O2的无血清培养液中培养24 h，用于后续实验。

1.2.3细胞转染 当受损PC12细胞密度达到70%汇合时，将其接种于6孔板(1×105个细胞/孔)中培养。培养3 h后，使用Lipofectamine®2 000将miR-301a-3p mimic(100 nM)，miR-301a-3p inhibitor(100 nM)，SNX27 siRNA(30 nM)或阴性对照(NC mimic，NC inhibitor)转染到细胞中。为了在受损PC12细胞中过表达SNX27，使用Lipofectamine 2 000(Invitrogen)将构建的腺病毒介导的SNX27过表达载体(Ad-SNX27，2 μM)和阴性对照空白腺病毒载体转染到细胞中。

1.2.4脊髓运动功能评价 分别在SCI后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d和28 d对大鼠脊髓损伤模型组(SCI)和假手术组(Sham)采用0～21分的BBB (Basso-Beattie-Bresnahan)评分法评定大鼠的运动功能恢复情况，每项指标共评定3次。分数越高表明大鼠的运动功能越正常。由两名经验丰富的研究人员对各组大鼠进行独立观察。在进行评分实验前做好检查，防止因其他因素影响行动而引起实验误差。

1.2.5实时荧光定量PCR(qPCR)检测脊髓组织和受损PC12细胞中miR-301a-3p和SNX27 mRNA的表达水平 使用Trizol试剂从受损脊髓组织或PC12细胞中提取总RNA样本，并用紫外分光光度计(260 nm)检测RNA的含量和纯度。为了检测miR-301a-3p的表达，用TaqMan MicroRNA反转录试剂盒合成cDNA，并用SYBR Green PCR Master Mix进行PCR扩增，U6用作miRNA的内参。为了检测SNX27的mRNA表达，使用Takara反转录试剂盒进行反转录，并使用SYBR Green PCR Master Mix扩增反转录后的产物。然后采用Applied Biosystems 7900HT qPCR系统按照以下热循环参数进行qPCR：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，共40个循环。通过2-ΔΔCt法计算相对表达量。GAPDH用作mRNA的内参。

1.2.6Western blot 检测SNX27、凋亡相关蛋白(Cleaved-caspase 3和Bcl-2)以及轴突相关蛋白(Gap-43和NF-200)的相对表达量 收集受损PC12细胞裂解物，然后加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂提取PC12细胞中的总蛋白质，使用BCA试剂盒检测蛋白浓度。将30 μg/孔蛋白质通过10%的SDS-PAGE 凝胶进行电泳，然后转移到PVDF膜上(电压100 V，时间2 h)。转膜后，在室温下用5%脱脂牛奶将膜封闭1 h，并与一抗[SNX 27(1：800)、Cleaved-caspase 3和Bcl-2(1：500)、NF-200和Gap-43(1：1 000)以及GAPDH(1：3 000)抗体]结合，4 ℃下孵育过夜，然后用TBST洗PVDF膜3次。最后，在室温下与IgG (1：1 000)孵育2 h后，用ECL化学发光剂盒进行染色和凝胶图像分析。用GAPDH为作为内参。

1.2.7流式细胞术检测受损PC12神经细胞凋亡率 采用FITC凋亡试剂盒检测各组细胞的凋亡水平。转染后48 h，将PC12细胞(1×105)悬浮于300 μL1×Binding buffer缓冲液中，再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，然后在室温下避光放置约15 min，最后使用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。

1.2.8双荧光素酶报告基因实验验证miR-301a-3p和SNX27之间的靶向调控关系 利用生物信息学预测工具TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_71/) 和miRBase (http://www.mirbase.org) 预测miR-301a-3p和SNX27的结合位点，合成SNX27基因片段。将具有结合位点的野生型(WT)和突变型(MUT)SNX27 mRNA 3’-UTR序列与pmiR-GLO双荧光素酶载体质粒连接以获得pmi RGLO-SNX27 3’-UTR重组报告质粒，然后在24孔板上使用Lipofectamine®2 000将pmi RGLO-SNX 27 3’-UTR重组报告质粒和NC mimic (阴性对照)、miR-301a-3p模拟物(miR-301a-3p mimic)共转染到HEK-293细胞中。共转染48 h后收集细胞，然后采用酶标仪检测细胞的荧光素酶活性。

2 结 果

2.1SCI组和Sham组的BBB评分比较 与Sham组相比，SCI后大鼠在1 d、3 d、7 d、14 d、21 d和28 d的BBB评分明显较低，这说明SCI后大鼠的脊髓运动功能明显减退(*P<0.05，**P<0.01)，同时也表明大鼠脊髓损伤模型构建成功。此外，随着时间的增加，SCI后大鼠的运动功能逐渐得到恢复，并趋于正常。见图1。

2.2SCI大鼠受损脊髓组织中miR-301a-3p和SNX27 mRNA的表达情况 从qPCR检测结果可以看出，与Sham组相比，SCI后大鼠脊髓组织中miR-301a-3p的相对表达水平在7～21 d时明显降低，并在21 d达到最小值(图2A)；而SNX27在各时间点的mRNA水平则均明显高于Sham组，并且随着时间的增加而增高(图2B)。总之，大鼠SCI模型中miR-301a-3p的表达下调，而SNX27呈现与之相反的表达模式。

2.3过表达miR-301a-3p对受损PC12细胞凋亡和轴突再生相关蛋白(Gap-43和NF-200)的影响 qPCR检测miR-301a-3p mimic转染效率显示，Control组(1.00±0.080)、H2O2组(0.40±0.070)、H2O2+NC mimic组(0.42±0.130)、H2O2+miR-301a-3p mimic组(2.10±0.090)，表明受损PC12细胞中miR-301a-3p的表达水平明显下调(P<0.05)；而在受损PC12细胞中过表达miR-301a-3p后，其表达水平则显著上调(P<0.01)。流式细胞术和Western blotting实验结果表明，受损PC12细胞的凋亡率明显增加，并且Cleaved-caspase 3和Bcl-2的表达水平也显著上调和下调；而在受损PC12细胞中过表达miR-301a-3p可明显降低细胞的凋亡效果(图3A和3B)；此外，受损PC12中轴突再生相关蛋白Gap-43和NF-200的表达量显著下调，而过表达miR-301a-3p则改变了这一结果(图3C)。这些数据表明，miR-301a-3p能够抑制受损PC12细胞的凋亡，并促进轴突再生。

2.4抑制miR-301a-3p表达对受损PC12细胞凋亡和轴突再生相关蛋白(Gap-43和NF-200)的影响 受损PC12细胞中miR-301a-3p的表达水平显示，Control组(1.00±0.070)、H2O2组(0.59±0.060)、H2O2+NC inhibitor组(0.60±0.078)、H2O2+miR-301a-3p inhibitor组(0.21±0.069)，结果表明在受损PC12细胞中转染miR-301a-3p inhibitor后，miR-301a-3p表达水平明显下调(P<0.01)。流式细胞术和Western blotting实验结果表明，在受损PC12细胞中转染miR-301a-3p inhibitor能够进一步增强受损PC12细胞的凋亡效果(图4A和4B)。同时，在受损细胞中抑制miR-301a-3p表达可进一步抑制Gap-43和NF-200的表达(图4C)。因此，抑制miR‐301a‐3p表达能够促进受损PC12细胞的凋亡，抑制轴突再生能力。

2.5miR-301a-3p对SNX27 的靶向调控作用 利用生物信息学预测工具对miR-301a-3p的靶基因分析发现，SNX27是miR-301a-3p的靶点(图5A)。双荧光素酶报告基因实验结果表明，与对照组相比，miR-301a-3p显著降低了含有野生型SNX27结合位点的荧光素酶活性(P<0.01)，但不影响突变型SNX27的荧光素酶活性(图5B)。为了验证上面的结果，我们进一步探究了miR-301a-3p对SNX27表达水平的调控作用，Control组(1.00±0.081)、H2O2组(2.10±0.070)、H2O2+NC mimic组(2.10±0.091)、H2O2+miR-301a-3p mimic组(0.40±0.020)、H2O2+NC inhibitor组(2.01±0.069)、H2O2+miR-301a-3p inhibitor组(3.10±0.078)，实验结果表明在受损PC12细胞中过表达miR-301a-3p后，SNX27的mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.01)，而抑制miR-301a-3p表达则显著上调了SNX27的mRNA和蛋白表达水平(P<0.05)(图5C)。这些结果表明miR-301a-3p能够直接靶定SNX27 mRNA的3’-UTR，并与SNX27呈相反的表达模式。

2.6miR-301a-3p靶向调控SNX27对受损PC12细胞凋亡和轴突再生相关蛋白(Gap-43和NF-200)的影响 在受损PC12细胞中转染Ad-SNX27可显著上调SNX27蛋白水平的表达，而转染SNX27 siRNA则下调SNX27的蛋白表达(图6A)。受损PC12细胞中SNX27影响miR-301a-3p对细胞凋亡的调节作用显示Control组(5.0±0.40)、H2O2组(25.0±0.65)、H2O2+miR-301a-3p mimic组(11.0±0.78)、H2O2+SNX27 siRNA组(10.5±0.49)、H2O2+miR-301a-3p mimic+Ad-SNX27组(24.0±0.58)，结果表明在受损PC12细胞中过表达miR-301a-3p和干扰SNX27均可减弱细胞凋亡效果，促进轴突相关蛋白Gap-43和NF-200的表达，再次验证了miR-301a-3p与SNX27呈相反表达模式的结论；此外，过表达SNX27后能够减弱miR-301a-3p对细胞凋亡的抑制作用，以及对轴突相关蛋白Gap-43和NF-200表达的促进作用(图6B)。以上实验结果均表明miR-301a-3p能够通过下调SNX27进而抑制SCI后神经细胞的凋亡和促进神经轴突的生长。

3 讨 论

SCI是脊柱外科常见的疾病之一，它可导致脊髓周围长期细胞损伤和局部炎症的发生，甚至可能导致相关神经通路的损伤，最终造成患者肢体麻木甚至瘫痪。引发SCI的发病机制主要有脊髓原发性损伤和脊髓继发性损伤。近年来，随着深度测序的发展，出现了一些针对SCI患者的新治疗手段，其中包括miRNAs。本文探究SCI后miR-301a-3p对神经细胞功能的作用及其在神经损伤修复过程中的分子机制。结果表明在损伤脊髓组织中miR-301a-3p的表达下调，SNX27呈现相反的表达模式。体外实验证明miR-301a-3p过表达能够抑制SCI后神经细胞凋亡，并促进神经轴突相关蛋白Gap-43和NF-200的表达。双荧光素酶报告基因实验表明miR-301a-3p通过直接靶定SNX27对SCI后神经细胞功能恢复进行调节。此外，过表达SNX27基因能够拮抗miR-301a-3p对细胞凋亡和神经轴突再生能力的影响。

研究表明，miRNAs在SCI后神经细胞凋亡过程发挥重要作用。本研究结果表明，在大鼠SCI模型中miR-301a-3p的表达量下调，当在损伤细胞中转染miR-301a-3p mimic或miR-301a-3p inhibitor时，细胞凋亡水平受到减弱或增强，这与上述的miRNAs对SCI后神经细胞凋亡效果的影响一致。此外，miRNAs的特异性表达可通过调节SCI后的蛋白表达而参与SCI后神经功能恢复过程[5-6]。我们的研究结果也证明了miR-301a-3p可上调神经轴突相关蛋白Gap-43和NF-200的表达，促进神经功能恢复。SNX27作为SNXs蛋白家族成员之一，是一种重要的分选蛋白，可以将包括受体在内被内吞的膜表面蛋白重新送回细胞膜。SNX27的缺失会造成神经病理改变，导致多种神经性疾病的发生。有研究表明，SNX27缺失会影响突触受体循环过程，而过表达SNX27能够提高小鼠的突触可塑性和学习记忆能力，且未出现癫痫表型。SNX27表达下调会造成唐氏综合征疾病，导致患者的认知功能发生障碍。SNX27缺失可促进神经毒性蛋白β-淀粉样蛋白(Aβ)的产生，从而导致阿尔兹海默症的发生。此外，在小鼠脊髓背根神经节结扎损伤模型中，SNX27表达量上调影响mGluR5上膜，进而调控SCI后的神经性疼痛。SNX27缺失能够降低神经元的凋亡水平，并抑制小胶质细胞增殖与募集以减轻局部炎症反应，进而促进SCI后功能恢复[10]。而SNX27在SCI后神经功能恢复的机制尚未清楚。通过qPCR实验发现，在大鼠脊髓损伤模型中，SNX27的表达水平上调；而干扰SNX27表达可以减弱由细胞损伤引起的细胞凋亡，并提高Gap-43和NF-200蛋白表达水平。这再次证明了SNX27对SCI后的神经功能恢复起抑制作用。此外，过表达SNX27能够拮抗由miR-301a-3p上调而造成的细胞凋亡减弱和轴突再生能力。此结果表明miR-301a-3p可通过靶向SNX27，抑制SNX27的表达，最终调控损伤神经细胞的凋亡水平和轴突再生能力。

综上所述，在大鼠SCI模型中，miR-301a-3p可以通过靶向抑制SNX27的表达，降低神经细胞的凋亡水平，增强轴突再生能力，进而促进SCI后神经功能恢复。

(本文图1～图6见封三)