肖玉娟 甘美裕 林俊杰 庄峙厦 何少贵 傅 奇

(厦门华厦学院环境与公共健康学院，厦门 361024)

DHA是一种具有多种生理功能的多不饱和脂肪酸[1-3]，在食品、药品以及饲料等领域得到广泛应用[4-6]。DHA的主要来源包括深海鱼类和微生物[7]，其中利用微生物发酵生产DHA由于生产周期短、产量高、培养条件简单、可规模化生产等优点，已成为DHA最主要的来源之一[8-10]。

破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)包括Aurantiochytrium、Schizochytrium、Oblongichytrium等属[11]，其中Aurantiochytrium和Schizochytrium属的多个种可以生产DHA[12, 13]，2010年，我国批准了Schizochytrium属生产的DHA藻油作为新资源食品(卫计委2010年第3号令)。Chang等[14]的研究表明，Aurantiochytrium属菌种与Schizochytrium属菌种相比，在培养基利用和脂肪酸生产上具有自身的特色和优势，同一属的不同菌株在DHA表达上也有较大的差异，筛选产DHA的不同种类破囊壶菌具有一定的研究价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本

分离菌株样本为腐木，采集于厦门市集美区红树林，置于4 ℃冷藏[15]。

1.1.2 试剂

2216E(液体)；2216E琼脂；葡萄糖(食品级)；酵母浸粉；海水晶；谷氨酸钠、维生素B1、维生素B12、泛酸钙、氨水(25%～28%)、乙醇、石油醚：分析纯，DHA甲酯标准品(色谱纯)；真菌DNA提取试剂盒；ITS扩增引物ITS1: 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’、ITS4: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。

1.2 仪器与设备

Aeris-bg096型PCR仪，HE99型核酸电泳仪，211B型摇床，LRH-250型生化培养箱，Quanta450型扫描电镜，GC-2010plus型岛津气相色谱，GUJS-50L型发酵罐，BL-18X型真空冷冻干燥器。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

取腐木25 g加入225 mL 2216E液体培养基拍打均质，4层纱布过滤后，于外加3%葡萄糖的2216E琼脂平板稀释涂布，28 ℃培养72 h，取细胞直径显著大于酿酒酵母的球状菌菌落划线纯化[15]。

1.3.2 细胞形态观察

纯化后的菌株接种至添加3%葡萄糖的2216E液体培养基，28 ℃培养48 h，0.22 μm滤膜过滤收集细胞，取滤膜进行扫描电镜观察细胞形态。

1.3.3 菌种鉴定

用真菌基因组DNA抽提试剂盒，提取菌株的总DNA；用ITS引物扩增(具体的引物序列)，所得PCR产物电泳纯化后进行测序。

ITS扩增条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火55 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。

将测序结果在Genbank进行比对，选择相似度较高的菌种序列，分别用BioEdit[16]和Clustal X[17]进行比对和编辑，取有效区间，采用最大简约算法，用Paup* 4.0构建进化树[18, 19]，选择AspergillusnigerATCC 16888[20]作为外群。

1.3.4 发酵

由于破囊壶菌对氧、补料和pH控制要求较高，为了保证脂肪酸组成分析结果与工业生产过程相一致，使用50 L发酵罐进行菌体培养，并结合文献报道与预实验结果选择发酵条件。

种子培养基使用成品2216E液体培养基加入3%葡萄糖，30 ℃，180 r/min培养48 h。

发酵培养基[21, 22]：葡萄糖 5 g/L，酵母浸粉 5 g/L，谷氨酸钠 10 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，海水晶 12 g/L，维生素B10.009 5 g/L，维生素B120.000 15 g/L，泛酸钙 0.003 2 g/L。

50 L发酵罐中初始装液量为25 L；接种量为10%；发酵温度为30 ℃；4h后流加饱和葡萄糖溶液，控制发酵液残糖在5 g/L，96 h停止补料；10%磷酸和氨水控制pH在5.5～6.5；初始搅拌速度为200 r/min，初始通气比为1∶0.5，通过调节搅拌速度和通气量控制溶解氧(DO)在12 h内不低于20、40 h内不低于5，40 h后保持在0左右[23]；98 h放罐，每4 h取样测发酵液残糖，每8 h取样检测发酵液中生物量及细胞中的总脂肪酸和DHA含量。

1.3.5 生物量、残糖与油脂检测

生物量：取发酵液100 mL于8 000 r/min离心，弃上清液后，去离子水振荡洗涤2次，真空冷冻干燥2 d称质量。

残糖：DNS法测定发酵液中葡萄糖[24]。

总脂肪：按照GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的测定》酸水解法测定总脂肪。

脂肪酸测定：提取的总脂肪按照GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的测定》皂化并甲酯化后，按照外标法测定DHA[25]。

2 结果与分析

2.1 菌株分离纯化

从海水腐木中筛选得到一株球状真菌，菌落白色、湿润，编号为HX2019010，细胞形态, HX2019010细胞扫描电镜图如图1所示，放大倍数为6 000倍，左侧为年轻细胞，右侧中褶皱较多的细胞为老龄细胞。

图1 HX2019010细胞扫描电镜图

2.2 菌种鉴定

菌株HX2019010 ITS序列经测序拼接后，得到460 bp有效序列，于Genbank进行比对发现该序列与Aurantiochytrium、Schizochytrium、Thraustochytrium等破囊壶菌科菌株相似度相对较高。选择相似度较高的菌株ITS序列构建进化树, 基于ITS序列的进化树如图2所示。

树长为2 290，一致性指数(CI)为0.527，保留指数(RI)为0.774，同性指数(HI)为0.473。各分枝自展值较高，树形结构可靠，其中HX2019010菌株与Aurantiochytrium聚合在一枝。但值得注意的是该菌株ITS序列与Genbank中现有ITS序列全序列相似度较低，相似度最高的AurantiochytriumlimacinumIMB177、AurantiochytriumlimacinumIMB181菌株也仅有部分区域相似度达92%，不足以判定为同一个种，因此，结合细胞形态，初步鉴定为Aurantiochytriumsp. HX2019010。ITS序列上传至Genbank，序列号为MN931688。

2.3 发酵曲线

发酵过程中pH、DO、残糖、生物量、总脂肪和DHA含量曲线, 菌株HX2019010发酵曲线如图3所示，此批曲线仅用于标示后续用于脂肪酸组成分析所用细胞的制备过程，不代表最优发酵条件。

图2 基于ITS序列的进化树

从图3可以看出，菌株HX2019010在此培养条件下快速生长并合成DHA，接种后8 h左右进入对数生长期，56 h后细胞中脂肪大量积累。98 h发酵后，生物量可达108.27 g/L；干细胞中总脂肪含量达26.26%，发酵液中脂肪含量达28.43 g/L；DHA占细胞干质量的8.47%，发酵液中DHA含量达9.17 g/L。

图3 菌株HX2019010发酵曲线

从总脂肪与DHA增长曲线可以看出，后期总脂肪和DHA都在积累，但DHA在脂肪酸中的比例有所降低，与裂殖壶菌发酵过程中后期DHA大量积累有显著差异[26-28]，可能系培养条件更有利于Aurantiochytriumsp. HX2019010积累其他脂肪酸组分或不利于其他脂肪酸向DHA转化，后续将继续对其发酵条件进行优化。

2.4 脂肪酸组成

发酵罐中培养48 h和98 h的Aurantiochytriumsp. HX2019010细胞离心、洗涤，真空冷冻干燥48 h后，按照GB 5009.168—2016外标法进行测定，脂肪酸含量以每100 g干细胞中的脂肪酸质量计，Aurantiochytriumsp. HX2019010脂肪酸组成见表1。Aurantiochytriumsp. HX2019010细胞主要脂肪酸组成为棕榈酸(35.57%～37.41%)、DHA(32.25%～45.86%)和肉豆蔻酸(7.43%～9.22%)。发酵98 h后细胞中各种脂肪酸含量普遍高于48 h细胞，总脂肪酸含量增加103.42%，其中棕榈酸增加93.37%，肉豆蔻酸增加152.35%，DHA增加43.07%。在发酵后期，DHA积累相对较少，表明DHA的合成受到抑制，可能与氧、有机氮源和生物素供应不足以及培养温度有关[29]。

菌株Aurantiochytriumsp. HX2019010胞内脂肪酸中DHA比例波动较大，较高值可达45.86%，高于商业化生产DHA的裂殖壶菌SchizochytriumlimacinumSR21中DHA比例(32%～40%)，但胞内总油脂含量较低[23]。与牟桐等[30]筛选的6株破囊壶菌相比，饱和脂肪酸棕榈酸和肉豆蔻酸含量较高，但总油脂产量也较高。与李晶晶等[31]筛选的破囊壶菌Sw7菌株脂肪酸组成较为相似，总脂肪酸含量较低，但发酵液中细胞密度显著较高。

表1 Aurantiochytrium sp. HX2019010脂肪酸组成

综合分析，菌株Aurantiochytriumsp. HX2019010在发酵罐中可实现高密度发酵，且DHA占总脂肪酸含量较高，DHA产量显著高于已报道的Aurantiochytrium属菌株[29]，具有进一步研究的价值，但细胞中油脂含量较低，且发酵后期DHA积累较少，有待于进一步优化发酵条件。

3 结论

从厦门市集美区海水腐木中筛选得到一株产DHA的球状真菌HX2019010，经ITS序列比对与系统发育分析，结合扫描电镜观察，初步鉴定为Aurantiochytriumsp. HX2019010。该菌株在50 L发酵罐中可实现较高密度的发酵，98 h培养后发酵液中生物量可达108.27 g/L，脂肪含量达28.43 g/L，DHA含量达9.17 g/L。细胞中脂肪酸主要成分为棕榈酸、DHA和肉豆蔻酸，含量与比例受发酵时间或培养条件的影响，其中DHA占总脂肪酸的32.25%～45.86%，具有进一步研究的价值。该菌株ITS序列与Genbank中现有破囊壶菌序列存在较大差异，不排除其为Aurantiochytrium新种的可能性，有待进行全基因组平均核苷酸一致性(Average Nucleotide Identity, ANI)分析。