宋贤奎 谢冠博 吴宁 李锦 韩笑 郭红延

口腔颌面部常见的炎症性疾病均会导致急慢性疼痛，目前针对这些疾病的镇痛药物通常为非甾体类镇痛药，但用药后有可能引发胃肠刺激、胃溃疡、肝肾异常、出血倾向和心血管损害等不良反应［1］，使其在长期使用或特殊人群中的使用受到限制。由此，寻找新的抗炎镇痛替代药物尤为必要。

大麻二酚（cannabidiol，CBD）是大麻提取物中一种无精神活性的化合物，有研究表明其参与情绪调节、抗惊厥、抗炎、镇痛以及免疫调节等过程［2］。有报道发现在足底炎性痛模型中CBD具有镇痛作用［3］，但其对于颌面部炎性痛的作用尚未见报道。口腔颌面部与躯体四肢部位的疼痛传导通路不同，三叉神经脊束核是颌面部疼痛信息传导至中枢的第一个核团，疼痛信息的传导与其尾侧亚核密切相关［4］。

本实验以布洛芬（IBU）作为阳性对照药，利用小鼠口腔颌面部福尔马林致炎性痛模型，评价CBD对于颌面部炎性痛的镇痛作用，并进一步研究其发挥作用的可能神经生物学机制，以期为临床上相关疼痛的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 动物

8周龄雄性SPF级 C57BL/6J小鼠，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司（质量合格证号 No.110324200102581774，No.110324200102925735）。恒温（23±1）℃、12 h明/暗灯光循环饲养，自由进食饮水。

1.2 口腔颌面部炎性痛模型建立

模型小鼠在右侧鼻旁唇部触须垫皮下注射1%福尔马林溶液30μL，之后将其单只放入20 cm×15 cm×20 cm聚乙烯透明观察盒中进行观察，观察盒后放置观察镜。将45 min平均分为15个时间段，每个时间段时长为3 min，其中0～6分钟即为一相痛，12～45 min即为二相痛。

1.3 实验分组

选取40只 C57BL/6J小鼠随机分为对照（control）、模型（model）、CBD 30 mg/kg（CBD30）、CBD 60 mg/kg（CBD60）和IBU 5组，每组8只。腹腔注射溶剂（control和 model组）、CBD 30 mg/kg（CBD 30组）、CBD 60 mg/kg（CBD 60组）、布洛芬 90 mg/kg（IBU组），1 h后鼻旁唇部触须垫皮下注射生理盐水（control组）或1%福尔马林30μL；如1.2所述记录抓脸时间。完成行为学观察后，待小鼠在注射盐水或福尔马林1 h后，取对照组、模型组、CBD60、IBU这4组唇部炎性组织进行RT-qPCR检测。另外选取24只小鼠随机分为如上4组（n＝6），同样进行疼痛反应行为学观察，完成观察后，在注射生理盐水或福尔马林2 h后取脑，进行免疫荧光染色。

1.4 RT-qPCR

唇部炎性组织剪碎后加入1 mL TRIzol，进行组织破碎。按照RNA提取试剂盒说明书步骤提取总RNA。测浓度后，反转录为cDNA（42℃15 min、95℃3 min）。按照荧光定量PCR试剂盒说明书配制20μL荧光定量PCR体系，在ABI 7500实时荧光定量PCR系统中运行检测，反应条件为95℃5 min；95℃10 s，60℃40 s，共40个循环。引物序列如表 1。以2－ΔΔCt法进行相对定量。

表1 RT-qPCR引物序列Tab 1 Sequences of the primers for RT-qPCR

1.5 免疫荧光实验

待取材小鼠以70 mg/kg戊巴比妥钠生理盐水溶液腹腔注射进行麻醉后以生理盐水和4%多聚甲醛溶液灌流，将完整脑部取出后以4%多聚甲醛溶液固定4 h，换30%蔗糖水溶液4℃脱水24 h，进行冰冻切片。室温封闭1 h（0.3%triton x-100、5%BSA、PBS溶液），抗c-Fos抗体（1∶400）4℃孵育过夜，二抗（1∶500）避光室温孵育1 h。以荧光显微镜拍摄脑片。

1.6 统计学分析

2 结 果

2.1 小鼠福尔马林口腔颌面部疼痛模型建立

模型组小鼠的抓脸时间呈现经典的两相痛反应：在6 min内小鼠出现快速且密集的抓脸行为，该时程反应为一相痛；12～45 min小鼠再次表现出密集的抓脸行为，该时程反应为二相痛。双因素方差分析显示，处理（F［1，14］＝273，P＜0.001）、时间（F［5，74］＝7.28，P＜0.001）以及两者的交互作用（F［14，196］＝6.62，P＜0.001）均对抓脸时间有显著影响。Turkey后检验显示，模型组一相痛和二相痛的抓脸时间均明显高于对照组（图 1）。

图1 唇部注射福尔马林后小鼠抓脸时间变化（与对照组相比，*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001）Fig 1 Face-rubbing time after injection of formalin（Compared with the control group，*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001）

一相痛时程中，抓脸总时间的单因素方差分析显示处理因素显著影响抓脸时间（F［4，35］＝9.45，P＜0.001），模型组小鼠的抓脸总时间显著高于对照组（P＜0.001），而CBD和IBU组抓脸时间与模型组相比均无显著差异（P＝0.91，P＝0.17，图 2A）。二相痛时程中抓脸总时间（图2B）的单因素方差分析显示处理因素显著影响抓脸时间（F［4，35］＝46.5，P＜0.001）。Turkey后检验显示，模型组的二相痛抓脸总时间显著高于对照组（P＜0.001），CBD60和IBU组的二相痛抓脸总时间均显著低于模型组（P＜0.01，P＜0.01），而CBD30组抓脸时间与模型组比无显著差异（P＞0.99）。

图2 各组一相痛（A）和二相痛（B）时程抓脸总时间（与对照组相比，*P＜0.001；与模型组相比，＃P＜0.01）Fig 2 The total face-rubbing times in phase 1（A）and phase 2（B）（Compared with the control group，*P＜0.001；Compared with the model group，＃P＜0.001）

2.2 唇部组织炎性因子mRNA表达变化

对不同处理组的各类炎性因子的表达变化进行了检测，发现与对照组相比，模型组 IL-1β（图 3，F［3，28］＝9.49，P＜0.001）、IL-6（图 3，F［3，28］＝6.44，P＜0.01）、TNF-α（图 3，F［3，28］＝5.10，P＜0.01）以及COX-2（图 3，F［3，28］＝10.2，P＜0.001）的 mRNA表达均显著升高，而 FAAH（图 3，F［3，28］＝2.75，P＝0.25）和 15-PGDH（图 3，F［3，28］＝0.311，P＝0.98）的表达无显著变化；与模型组相比，CBD（60 mg/kg）和布洛芬均能显著降低 IL-1β（P＜0.01，P＜0.01）、IL-6（P＜0.05，P＜0.05）、TNF-α（P＜0.05，P＜0.05）以及 COX-2（P＜0.05，P＜0.05）的 mRNA表达，而且CBD（60 mg/kg）还能降低 FAAH的 mRNA表达（P＜0.05）；各组中15-PGDH的表达未表现出显著差异（P＝0.99，P＝0.96）。

图3 唇部炎性组织 mRNA表达（与对照组相比，**P＜0.01；***P＜0.001；与模型组相比，＃P＜0.05；＃＃P＜0.01）Fig 3 The mRNA expression in inflammatory lip tissue（Compared with the control group，**P＜0.01，***P＜0.001；compared with the model group，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01）

2.3 三叉神经脊束核尾侧亚核（sp5c）c-Fos阳性细胞数量变化

本实验中首先观察了各组小鼠的疼痛行为反应，结果同2.1，在此未重复展示。通过免疫荧光实验观察到与对照组相比（图4），模型组sp5c浅层有大量c-Fos表达（图4）。腹腔给予CBD 60 mg/kg后sp5c的c-Fos表达明显降低（图4，CBD60组），而给予布洛芬后无此现象（图4，IBU组）。对c-Fos阳性神经元数量进行统计，单因素方差分析显示（图 5，F［3，20］＝22.9，P＜0.001，n＝6），模型组的 c-Fos阳性神经元数量显著高于对照组（P＜0.001），CBD60组c-Fos阳性细胞数量显著低于模型组（P＜0.05），而IBU组与模型组没有显著差异（P＝0.39）。

图4 各组盐水或福尔马林注射后2 h sp5c中c-Fos的表达 （免疫荧光，×10）Fig 4 The expression of c-Fos in sp5c 2 h after injection of saline or formalin （Immunofluoresence，×10）

与对照组相比，*P＜0.001；与 model组相比，＃P＜0.05图5 c-Fos表达统计学结果Compared with the control group，*P＜0.001；compared with the model group，＃P＜0.05Fig 5 The statistical result of c-Fos expression

3 讨 论

在口腔临床工作中，牙周炎、牙髓炎、疖痈、黏膜炎等均是常见的口腔颌面部炎性疾病，伴随这些疾病的通常是非常令人不快的疼痛感，而缓解与之相关的疼痛是患者和临床工作者的共同目标。本实验中CBD（60 mg/kg，i.p.）能够显著降低福尔马林致炎后的小鼠抓脸时间，提示CBD对于颌面部炎性痛的镇痛具有良好的药效学作用。

炎性因子对炎症的发生发展有诱导促进作用，它们由活化的巨噬细胞、T细胞和肥大细胞分泌［1］。IL-1β是由单核巨噬细胞分泌的［5］，能够通过激活 IL-1R1受体来增加TRPV1表达，进而提高热敏感性［6］。IL-6能够通过诱导前列腺素产生［7］、增加TRPV1、TRPA1表达［8］而引起炎性痛。TNF-α是重要的炎性介质之一［9］，诱导炎性痛是通过TNFR1受体和前列腺素介导的［10］，还能够通过 p38 MAPK介导的 Nav1.8和Nav1.9钠离子通道磷酸化快速调节疼痛感受器的敏感性［11-12］。本实验中，CBD和布洛芬均能够显著降低IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达。提示CBD与布洛芬均能够通过下调炎症因子水平发挥免疫调节作用，进而实现口腔颌面部的抗炎镇痛作用。

环氧合酶COX-2是一种能由促炎因子、内毒素和致癌基因刺激增加的诱导型酶，能够促进前列腺素的合成［13］。15-羟基前列腺素脱氢酶（15-PGDH）是前列腺素降解的关键酶，能够与COX-2协同调节前列腺素的含量［14］。本实验中，CBD和布洛芬均能够降低COX-2的mRNA表达，而15-PGDH的mRNA表达未受显著影响。提示两者可能通过减少前列腺素的合成而降低炎性反应和疼痛反应。

有研究表明，内源性大麻素水平的升高能够起到镇痛作用［15］，且内源性大麻素系统CB1受体的激活能够发挥突触前抑制，进而产生镇痛作用［16］。由于直接激动CB1可能会导致精神活性，抑制内源性大麻素水解酶脂肪酸酰胺水解酶（FAAH）来增加内源性大麻素含量可能是一种既能强化内源性大麻素系统作用、又能避免精神活性的用药策略［16］。CBD是CB 1受体的负性变构调节剂［17］，且作为FDA批准的上市药物具有良好的临床安全性［18］。本实验中CBD能够显著减少FAAH的mRNA表达，提示CBD可能通过增加内源性大麻素含量影响内源性大麻素系统发挥镇痛作用，而IBU无此作用。

sp5c的浅层是颌面部疼痛传入通路的重要中继站［4］。口腔颌面部疼痛信息通过三叉神经向中枢传输［19］。本实验发现CBD能够显著降低sp5c核团c-Fos表达，而IBU无此作用，提示CBD能够通过降低sp5c的神经元激活，抑制疼痛上行传导发挥镇痛作用。

总之，通过本实验发现，CBD能够降低小鼠口腔颌面部炎性痛，其可以通过下调炎性因子发挥抗炎镇痛作用；且与布洛芬相比，CBD可能通过抑制sp5c神经元的激活而阻碍疼痛上行传导、以及通过调节内源性大麻素水平发挥镇痛作用。且在本实验剂量下，未观察到任何不良反应。综上，CBD具有成为口腔颌面部炎性痛镇痛药物的潜力，本实验也为副作用更小的镇痛药物筛选提供了实验依据。