杨 帅 徐淑兵 金 岩 张国福 冯永新 王红艳*

（1 山东农业大学植物保护学院，山东泰安 271018；2 山东省农药检定所，山东济南 250100；3 河北中烟工业有限责任公司，河北石家庄 050051）

芦笋（Asparagus officinalis）又称石刁柏，为百合科天门冬属，是世界十大名菜之一，在国际市场上被称为“蔬菜之王”，我国是世界第一大芦笋生产国和出口国（鲁博，2018）。芦笋茎枯病由天门冬拟茎点霉菌〔Phomopsis asparagi（Sacc.）Bubak〕引起（刘克均 等，1991），是芦笋上发生最严重的病害之一，在全世界均有发生（陈光宇，2013）。随着芦笋连作和种植面积的扩大，茎枯病的危害越来越严重，影响了我国芦笋的出口创汇（吴玉娟 等，2018）。目前，茎枯病的防治方法以化学防治为主，但是长时间使用单一化学药剂，病菌的抗药性增强，常规杀菌剂的防治效果持续降低（Shi et al.，2020）；并且出口产品对农药残留的检测极其严格，亟需筛选高效、低毒、低残留的杀菌剂用于芦笋茎枯病的防治。

生物农药通常具有中低毒、无污染的优点，具有广阔的发展前景。而利用植物自身抗病性是作物病害综合防治中最有效、最经济的措施（Hadwiger，2013；Zhang et al.，2017）。因此，本试验在常见生物杀菌剂枯草芽孢杆菌、多抗霉素以及春雷霉素的基础上增加了香菇多糖和氨基寡糖素两种植物诱抗剂，明确了5种生物农药对天门冬拟茎点霉菌的毒力，检测了其对芦笋的安全性，通过田间药效试验明确其用量和防治效果，探讨生物农药替代化学药剂的可能性，为生物农药用于芦笋茎枯病的绿色防控提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株：天门冬拟茎点霉菌，由山东农业大学植物保护学院农药系从发病芦笋病茎上分离、鉴定并保存。

供试药剂：85%氨基寡糖素原药，5%氨基寡糖素水剂，10%香菇多糖原药，2%香菇多糖水剂，70%春雷霉素原药，6%春雷霉素可溶液剂，34%多抗霉素原药，5%多抗霉素水剂，含孢子1 000亿个·g-1的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂；对照药剂：97%苯醚甲环唑原药，10%苯醚甲环唑水分散粒剂。以上药剂均由山东省农药检定所提供。

供试芦笋品种：京绿1号，购自泰安市泰山区丰收种子站。

试验仪器：电子分析天平、移液枪、3WBD-16型背负式电动喷雾器（北京中保绿农科技集团有限公司）、生化培养箱等。

田间药效试验于2018年7月、2019年7月在泰安市岱岳区徂徕镇北望村进行。试验田土质为砂质壤土，试验小区的栽培管理条件均一致。

1.2 试验方法

1.2.1 室内毒力测定 将原药分别用丙酮溶解，加入无菌水进行稀释，制成10 mg·mL-1的母液，于4 ℃冰箱中保存备用。将各母液依次稀释，加入PDA培养基中，分别配成200、100、50、25、12.5、6.25 μg·mL-1的氨基寡糖素培养基，32、16、8、4、2、1 μg·mL-1的苯醚甲环唑培养基，200、100、50、25、12.5、6.25 μg·mL-1的多抗霉素培养基，120、60、30、15、7.5、3.75 μg·mL-1的春雷霉素培养基，200、100、50、25、12.5、6.25 μg·mL-1的香菇多糖培养基以及2 × 107、1 × 107、5 × 106、2.5 × 106、1.25 × 105、6.25 × 104cfu·mL-1的枯草芽孢杆菌培养基，以无药平板作对照，每个浓度4次重复。采用菌丝生长速率法，先将天门冬拟茎点霉菌在PDA培养基上进行预培养，然后将其接种到含药平板上，生化培养箱内25 ℃黑暗培养96 h，采用十字交叉法量取菌落直径，计算生长速率抑制率，采用DPS软件计算毒力回归方程、EC50值。

培养枯草芽孢杆菌，挑取单菌落斑点于液体LB培养基中过夜，恒温振荡培养制备种子液。以1%的接种量接种于液体LB培养基中，28 ℃、180 r·min-1培养箱中恒温振荡培养18 h，使用预先准备好的无菌液体LB培养基将发酵液浓度调整为1 × 1010cfu·mL-1，依次稀释为1 × 109、1 × 108、1 × 107、1 × 106、1 × 105cfu·mL-1。打取病原菌菌饼（d=5 mm），置于PDA平板中央，使用移液枪分别吸取上述梯度浓度发酵液1 μL，置于病原菌菌饼两侧1.5 cm处，以加入1 μL无菌水为对照，将培养皿倒扣培养于25 ℃恒温培养箱中，待对照平板上面的菌丝长至整个平皿直径的3/4处时，测量抑菌圈大小。

生长抑制率=〔1 -（处理菌落直径-菌饼直径）/（对照菌落直径-菌饼直径）〕 × 100%

1.2.2 5种生物农药对芦笋植株的安全性评价 参照NY/T 1965.1—2010《农药对作物安全性评价准则第1部分：杀菌剂和杀虫剂对作物安全性评价室内试验方法》测定5种药剂对芦笋植株的安全性，以推荐的田间药效试验最高剂量为最低试验剂量，按1、2、4倍剂量的梯度设计处理剂量。在温度（22 ± 3）℃，湿度65%，光周期14 h/10 h的日光温室内进行。根据药剂田间试验有效成分量，设5%氨基寡糖素AS 40、80、160 mL ·（667 m2）-1，2%香菇多糖AS 50、100、200 mL ·（667 m2）-1，6%春雷霉素SL 45、90、180 mL ·（667 m2）-1，5%多抗霉素AS 90、180、360 mL ·（667 m2）-1，含孢子1 000亿个·g-1枯草芽孢杆菌WP 40、80、160 g ·（667 m2）-1以及清水对照，每处理4次重复，每重复10盆，每盆1株。选择苗期生长一致的芦笋植株进行整株喷雾，用水量60 L ·（667 m2）-1。药后每天观察芦笋生长情况；药后15 d用布卷尺测量芦笋株高，检查生长状况，计算生长速率抑制率和安全系数。

生长速率抑制率=（空白对照生长速率-药剂处理生长速率）/空白对照生长速率 × 100%

安全系数=药剂对作物的最大无影响试验剂量/药剂田间最高推荐使用剂量

1.2.3 田间药效试验 药剂设计：CK（清水对照），5%氨基寡糖素AS 20、30、40 mL ·（667 m2）-1，2%香菇多糖AS 30、40、50 mL ·（667 m2）-1，6%春雷霉素SL 25、35、45 mL ·（667 m2）-1，5%多抗霉素AS 70、80、90 mL ·（667 m2）-1，含孢子1 000亿个·g-1枯草芽孢杆菌WP 20、30、40 g ·（667 m2）-1，10%苯醚甲环唑WG 48 g ·（667 m2）-1；每处理4次重复，采用随机区组排列，小区面积30 m2。

于芦笋茎枯病发病前或零星发病时进行整株喷雾，茎部主要着药，随水喷施药剂，用水量60 L ·（667 m2）-1，7 d后进行第2次喷药。处理后7、14 d记录发病情况。每个小区随机选取5点进行取样调查，每点调查20株植株的病害发生情况，计算病情指数和防治效果。病害调查参照贾海民等（2010）的方法。

病情分级标准：0级，整株无病斑；1级，主茎病斑绕茎长度占主茎周长25%以下，或侧枝发病量占总侧枝的25%以下；2级，主茎病斑绕茎长度占主茎周长25%～50%（含），或侧枝发病量占总侧枝的25%～50%（含）；3级，主茎病斑绕茎长度占主茎周长50%～75%（含），或侧枝发病量占总侧枝的50%～75%（含）；4级，主茎病斑绕茎长度占主茎周长75%以上，或侧枝发病量占总侧枝的75%以上。

病情指数=∑（病级株数 × 该病级值）/（检查总株数 × 最高级数值）× 100

防治效果=（对照区病情指数-处理区病情指数）/对照区病情指数 × 100%

2 结果与分析

2.1 5种生物农药对天门冬拟茎点霉菌的室内毒力测定

从表1可以看出，香菇多糖及氨基寡糖素对天门冬拟茎点霉菌没有明显的抑制活性；对照药剂苯醚甲环唑的EC50值为4.239 μg·mL-1，室内毒力较高，春雷霉素、多抗霉素的EC50值分别为60.184、86.438 μg·mL-1，枯草芽孢杆菌的EC50值为7.134 × 106cfu·mL-1。枯草芽孢杆菌发酵液浓度在1 × 108cfu·mL-1时对天门冬拟茎点霉菌抑制效果最好，抑菌圈直径为10.05 mm（表2）。

表1 5种生物农药对天门冬拟茎点霉菌的室内毒力测定

表2 枯草芽孢杆菌对天门冬拟茎点霉菌的室内活性

2.2 5种生物农药对芦笋植株的安全性评价

从表3可以看出：各处理植株在施药后3 d和15 d均无药害症状出现。施药后15 d，与对照相比，80、160 g ·（667 m2）-1枯草芽孢杆菌WP对芦笋株高生长量有显著抑制作用，200 mL ·（667 m2）-1香菇多糖AS对株高生长量有显著促进作用，其他处理株高生长量与对照无显著差异。表明5种生物农药田间试验剂量对芦笋生长安全。

表3 5种生物农药对芦笋生长的影响

2.3 5种生物农药对芦笋茎枯病的田间防效

由表4可知，随着药剂浓度的提高，各处理对芦笋茎枯病的防治效果也在上升。2018年试验中，药后7 d，5种生物农药田间试验的高剂量防治效果与对照药剂10%苯醚甲环唑WG差异均不显著，平均为75.16%～82.53%；2019年试验中，药后7 d，2%香菇多糖AS、5%氨基寡糖素AS、含孢子1 000亿个·g-1枯草芽孢杆菌WP田间高剂量的防治效果分别为69.89%、69.81%、72.75%，显著高于对照药剂10%苯醚甲环唑WG，6%春雷霉素SL、5%多抗霉素AS高剂量防治效果与对照药剂差异不显著。综合两年试验结果，施药后7 d，5种生物农药高剂量的防效与对照化学杀菌剂苯醚甲环唑相当，这5种生物农药对芦笋茎枯病的田间防治效果均较好。2018年含孢子1 000亿个·g-1枯草芽孢杆菌WP、2%香菇多糖AS以及5%氨基寡糖素AS田间试验高剂量的药后14 d防效可达66%以上；2019年含孢子1 000亿个·g-1枯草芽孢杆菌WP、2%香菇多糖AS以及5%氨基寡糖素AS田间试验高剂量的药后14 d防效可达54%以上，均显著高于对照药剂，表现出良好的持效性，且在本试验条件下，几种药剂对非靶标生物较为安全。

表4 5种生物农药对芦笋茎枯病的田间防治效果

3 结论与讨论

室内毒力试验表明，氨基寡糖素和香菇多糖对天门冬拟茎点霉菌没有直接抑制活性，春雷霉素和多抗霉素的毒力比对照药剂苯醚甲环唑低。杜宜新等（2013）报道了20种农药对天门冬拟茎点霉菌的室内毒力，其中氨基寡糖素对天门冬拟茎点霉菌无室内活性，本试验结果一致；孙燕芳等（2013）报道了春雷霉素对病原菌的室内毒力较低，也与本试验结果一致，但是这2个试验均未进行后续安全性和大田试验，也就无法确定这些药剂对芦笋茎枯病的实际防治效果。本试验在此基础上进行了5种生物农药的安全性与田间药效试验。结果表明，高浓度枯草芽孢杆菌对芦笋株高具有抑制作用，其他药剂对芦笋生长安全，高浓度香菇多糖对芦笋植株的株高还有一定的促进作用，与李鹏鹏等（2014）报道的香菇多糖促进黄瓜幼苗生长的结果一致。

两年田间药效试验结果表明，5种生物农药对芦笋茎枯病均具有良好的防治效果，2018年药后7 d田间高剂量防效平均为75.16%～82.53%；芦笋茎枯病在降雨多的时期发病重，发病高峰期一般在雨后7 d（许传征和蒋学杰，2020），2019年多阴雨天气，5种药剂田间高剂量平均防效均在65%以上；药后14 d，含孢子1 000亿个·g-1枯草芽孢杆菌WP 40 g ·（667 m2）-1、2%香菇多糖AS 50 mL ·（667 m2）-1以及5%氨基寡糖素AS 40 mL ·（667 m2）-1防治效果显著高于对照药剂，持效期较长，可以用于芦笋茎枯病的防治。并且生物农药具有中低毒、安全、无污染的优点，符合农药高效、低毒的发展方向，契合我国的可持续发展理念，应当被大力推广（王岩，2020）。

综上，5种生物农药均可用于芦笋茎枯病的绿色防控，其中枯草芽孢杆菌WP在田间推荐最大剂量的2倍及以上时〔80、160 g ·（667 m2）-1〕使用会抑制芦笋生长，需严格控制使用剂量。2%香菇多糖AS 50 mL ·（667 m2）-1、5%氨基寡糖素AS 40 mL ·（667 m2）-1对芦笋安全，防治效果好且持效期较长，推荐取得登记后用于芦笋茎枯病的绿色防控。