雷 阳 成 妍 乔 宁 焦彦生 吴越莉

（山西农业大学园艺学院，山西太原 030031）

黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）为雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）的代表病毒（Fan et al.，2019）。其寄主范围涵盖100个科中的1 200种植物，对辣椒的危害尤为严重（Wei et al.，2017）。在贵州、四川、湖南、湖北以及江浙等辣椒主产区，黄瓜花叶病毒的检出率在各种病毒中最高（陈玉珍等，2016）。国外抗CMV辣椒资源筛选工作开展较早，已鉴定出多个对CMV表现抗病的材料，如Perennial（Caranta &Palloix，1996）和Bukang（Kang et al.，2017），并获得了一系列辣椒品种。国内的辣椒种质资源丰富且栽培历史悠久，目前已经获得一些耐CMV的抗性资源（张晓敏 等，2015；李宁等，2016）。虽然目前国内外在辣椒CMV抗源筛选上已取得一定成效，但获得的抗病材料仍较少。利用辣椒抗病品种可有效解决化学药剂带来的农药残留、病菌抗药性等问题，因此挖掘抗病种质资源、探究抗病机理，在辣椒育种工作中具有很大的现实意义。

目前高通量测序技术已在生物学研究领域广泛应用，该技术可以快速、全面、准确地比较不同样本中存在显著差异的表达基因，通过生物信息学分析探究差异基因功能分类，进而筛选出与差异表型相关的基因群。刘永杰等（2016）对禾谷镰刀菌侵染后玉米幼根内转录组分析发现，镰刀烯醇毒素解毒基因、植物激素调节基因和磷脂酶D信号通路在玉米免疫禾谷镰刀菌的过程中发挥重要作用。雷阳等（2019）对辣椒抗感疫病材料转录组进行测序分析，在KEGG通路中筛选到117个抗病基因，主要包括植物激素调节、氧化磷酸化、植物激素信号传导、苯丙烷类次生代谢途径等过程，说明这些途径在辣椒免疫疫病的过程中高度活跃。李海录等（2017）对山定子接种褐斑菌后的叶片进行转录组测序，共筛选到94个抗病基因，涉及氨基酸代谢、植物激素信号传导等防御途径。王晓阳等（2020）对棉花短绒突变体和野生种的转录组进行测序分析，发现Ca2+信号传导、MAPK级联反应、氧化还原活性等途径的异常表达，使得突变体不能正常形成短绒纤维。Zhu等（2018）通过比较辣椒接种CMV的转录组，发现WRKY转录因子可能参与对病毒的免疫反应。

本试验以Illumina HiSeq 2500高通量测序技术为基础，从感病材料茄门和抗病材料JJ101中筛选与CMV抗性相关的转录本，从而深入了解辣椒抗CMV的转录组信息，从中筛选造成抗性差异的重要基因，为进一步揭示辣椒抗病动态过程、拓展抗病种质资源和抗病育种工作提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的86份辣椒材料（表1）均由山西省农业科学院蔬菜研究所搜集并提供。试验所用CMV BJ1分离物由中国农业科学院植物保护研究所惠赠。病毒接种在烟草叶片扩繁后，-70 ℃冰箱保存。

1.2 CMV接种方法和样品RNA提取

每份辣椒材料选择籽粒饱满、颜色和大小一致的种子播于72孔穴盘（基质为腐殖质∶珍珠岩=3V∶1V），于2018年4月在山西农业大学园艺学院（太原校区）温室中进行培养。待幼苗长至3～4片真叶时开始接种。以茄门为感病对照，以Perennial为抗病对照。CMV接种方法、病情分级标准及病情指数的计算均参照李宁等（2018）的描述。每份材料设置 3次重复，每个重复种植10株。

将筛选出的感病材料茄门和抗病材料JJ101的幼苗叶片分别接种CMV，茄门接种后0 h和72 h的2个处理，分别命名为QIEMEN-0h和QIEMEN-72h；JJ101接种后0 h和72 h的2个处理，分别命名为JJ101-0h和JJ101-72h。将样品叶片迅速置于液氮中冷冻，然后放在-80 ℃的超低温冰箱中保存备用。

利用TRIzol试剂提取茄门、JJ101各处理的总RNA，然后利用RNase-free DNase I除去总RNA中残余的DNA。利用TST-A831-1分光光度计检测茄门、JJ101叶片总RNA的浓度和纯度。

1.3 转录组文库构建及高通量测序

将提取的QIEMEN-0h、QIEMEN-72h、JJ101-0h和JJ101-72h 4个样品的叶片总RNA，参 考Orcheski和Brown（2017）的方法构建特异性文库。经RNA提取、纯化和文库构建后，将样品送至生工生物工程（上海）股份有限公司，利用Illumina HiSeq测序平台对文库进行双端测序。对QIEMEN-0h、QIEMEN-72h、JJ101-0h和JJ101-72h 4个样本原始数据进行过滤，剔除质量值低于20%的碱基。最后，利用FastQC对单基质量、碱基含量分布、GC含量分布、序列碱基质量等4个指标的数据进行质量控制分析。

1.4 转录组测序数据分析

将QIEMEN-0h、QIEMEN-72h、JJ101-0h和JJ101-72h 4个样本数据与辣椒参考基因组（Capsicum.annuum.L Zunla-1 Release 2.0，http：//peppersequence.genomics.cn/.）进行比对。采用Zatta等（2017）的方法，根据基因组注释信息，可得到序列的来源基因以及表达产物的结构，然后基于比对到基因的序列数目，用统计学方法计算表达量，并进一步比较基因、转录本和外显子在不同样品和分组之间的表达差异。为了能够在样品内以及样品间比较基因的表达量，采用RPKM（reads per kilo bases per million reads）对基因的表达量进行标准化，并在此基础上以FDR ≤0.001和|log2Ratio|≥1为条件筛选出2组样本间差异表达基因。

1.5 qRT-PCR验证

为了验证Illumina HiSeq测序后的差异基因准确性，对植物-病原菌互作通路（KO：04626）的10个差异表达基因进行qRT-PCR验证。使用软件Primer 5.0设计跨越内含子与外显子边界的引物，可有效剔除假阳性，防止qRT-PCR过程中扩增到基因组DNA影响试验结果。从QIEMEN-0h、QIEMEN-72h、JJ101-0h和JJ101-72h 4个 样本中各提取RNA 3.0 μg，利用PrimeScript®Reverse Transcriptese试剂盒进行反转录。以辣椒延伸因子EF-341α为内参基因，采用 SYBR®Premix ExTaqTM（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa，USA）进 行qRTPCR反应，每个反应重复3次，最后利用2−ΔΔCT方法分析结果。

2 结果与分析

2.1 86份辣椒种质资源的CMV抗性鉴定

对来源广泛的86份辣椒材料进行苗期CMV抗性鉴定，材料间表现出明显的抗性差异（表1）。其中，发病最严重的材料为茄门，病情指数为79.47，植株呈现明显矮化的症状，个别植株甚至死亡。而发病最轻的材料为JJ101，病情指数为18.67，接种CMV后仅轻微出现明脉和花叶的症状。在86份辣椒材料中，2份材料对CMV表现高感（DI ＞75），42份材料表现感病（50 ＜DI ≤75），37份材料表现中抗（30 ＜DI ≤50），5份材料表现抗病（10 ＜DI ≤30），未筛选出对CMV表现免疫（DI=0）及高抗（0 ＜DI ≤10）的材料。在5份抗病材料中，JJ101的抗性最好，甚至优于曾用于抗CMV遗传定位的法国材料Perennial，因此选用JJ101作为抗病材料进行后续试验。

表1 辣椒种质资源CMV抗性鉴定

2.2 转录组测序数据质量检测

4份材料叶片转录组测序数据统计和质量检测结果如表2所示。本次测序共获得碱基总数为27.60 Gb，其中样品JJ101-72h获得总碱基数最多，为7.43 Gb，样品QIEMEN-72h获得总碱基数最少，为6.31 Gb。在4个样品中，质量值≥30的碱基（Q30）最少的为样品QIEMEN-72h，为5.78 Gb，4个样品Q30百分比均在90%以上。GC含量在45.15%～46.64%的范围内。检测结果表明转录组测序具有较高的可信度，未出现异常数据，可保证后续分析结果的准确性。经过FastQC对原数据进行质量筛控，QIEMEN-0h、QIEMEN-72h、JJ101-0h、JJ101-72h样本数据量在一定程度上均有所减少，但高质量序列百分比最低的样品JJ101-0h也在96.49%以上，4个样本的质量分数均未低于Q20。

表2 测序数据统计

利用Tophat/Tophat2软件将有效数据与辣椒基因组数据进行比对，QIEMEN-0h、QIEMEN-72h、JJ101-0h、JJ101-72h样品与参考基因组匹配的序列占比分别为79.95%、78.81%、85.06%和84.73%（表3）。对文库的基因饱和度进行测试发现，随着测序数据量的增加，基因数量未见明显增多，说明测序数据量接近饱和。这些结果都表明，这4个样本可以进一步用于差异表达基因的分析。

表3 Clean reads与辣椒基因组比对基本信息

2.3 茄门和JJ101接种CMV的差异表达基因分析

采用 DESeq（version 2.11.0）软件对茄门和JJ101接种CMV 0 h和72 h后的基因表达进行差异分析，将接种CMV 0 h设为对照，可以消除基因型特异性和病毒转录组造成的背景干扰，从而获得与抗病和感病相关的更多数据。以表达倍数差异|log2fold-change|＞1，显著性P值＜0.05为条件筛选差异基因。首先对CMV侵染茄门前后的两组材料QIEMEN-72h和QIEMEN-0h进行差异比较，共得到1 633个显著差异表达基因，其中上调基因为657个，下调基因为976个。然后再对CMV侵染JJ101前后的两组材料JJ101-72h和JJ101-0h进行差异分析，共得到1 895个显著差异表达基因，其中上调基因为831个，下调基因为1 064个。

2.4 差异基因功能显著性富集分析

利用基因本体论（gene ontology，GO）富集分析JJ101和茄门在接种CMV后的显著差异基因的功能。结果显示，JJ101与茄门的1 158个差异基因中，有643个差异表达基因被富集。通过前20的GO子类可以看出（图1），大部分差异基因涉及分子功能和生化过程，而属于细胞组成的很少。在分子功能类别中，55个基因涉及碳氧裂解酶活性，53个基因涉及氧化还原酶活性，46个基因涉及过氧化物酶活性，38个基因涉及肽链内切酶活性，31个基因涉及萜烯合成酶活性，28个基因涉及催化活性，16个基因富集在了蛋白酶负调节活性，9个基因涉及裂解酶活性，8个基因涉及单氧酶活性；而生化功能类别中，37个基因富集在了代谢过程逆境反应，22个基因涉及氧化还原过程，20个基因涉及小分子代谢过程，17个基因涉及代谢过程，12个基因涉及防御反应。以上结果可以说明，JJ101和茄门的差异基因在两者体内调节了不同的酶类活性、产生了不同的代谢过程和造成了差异的防御反应，从而形成了两者对CMV的抗性差异。

图1 基因中前20的GO功能类别分析

在植物体内，不同基因相互协调作用共同行使生物学功能，为了研究JJ101在接种CMV前后有哪些生物学过程发生改变，将JJ101与茄门的1 158个差异基因与KEGG数据库数据进行对比，结果表明（图2），共有287个差异基因归入KEGG通路。在这些通路中，有42个基因富集在了泛素介导的蛋白水解作用通路，34个基因涉及植物激素信号传导通路，32个基因涉及RNA退化通路，22个基因富集在了氧化磷酸化通路，17个基因涉及cAMP信号通路，14个基因涉及氨基酸的生物合成通路，11个基因富集在了淀粉和蔗糖代谢通路，10个基因归类于mRNA监测通路，同时还有基因归类到了糖酵解通路、氨基糖和核苷酸糖代谢通路、VEGF信号通路、磷脂酶D信号通路、磷脂酰肌醇信号系统通路、黏液通路、MAPK信号通路、泛酸酯和CoA生物合成通路、内质网蛋白处理通路、氯烷烃和氯烯烃降解通路、RNA转运通路。值得关注的是植物-病原互作的相关基因发生了显著变化，共有10个差异基因归类到了这一途径，揭示该代谢通道相关基因发生了显著变化。在这10个基因中，Capana02g001851和Capana06g000269两个基因为类病原相关分子模式所触发的免疫反应蛋白基因5（pathogenesis-related genes transcriptional activator 5-like，PTI5）；Capana02g002076为 一氧化氮合酶基因（nitric-oxide synthase，NOS）；Capana05g001792为促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶1（mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1，MAPKKK1）；Capana02g000687为类促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶1（mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1-like）；Capana03g002879为促分裂原活化蛋白激酶4（mitogen-activated protein kinase 4，MAPK4）；Capana06g002562为类促分裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3-like）；Capana07g002392和Capana06g000196两个基因为抗病蛋白基因（disease resistance protein，RPM1）；Capana03g003522为抗性蛋白RGA1基因（表4）。

表4 植物-病原互作通路下差异基因的KEGG功能注释

图2 差异基因前20的KEGG通路功能分析

对基因本体论和KEGG的富集结果综合分析可发现，JJ101和茄门对CMV不同的抗性主要表现为逆境响应过程、酶类活性上的差异，同时蛋白代谢途径、植物激素调节等过程也与抗性差异相关，而在这些通路中植物-病原互作通路起着尤为重要的作用。

2.5 利用qRT-PCR荧光定量验证差异表达基因

为了验证转录组测序分析的差异基因的准确性和可靠性，利用实时荧光定量 PCR对植物-病原互作通路下的10个基因（表4）在JJ101接种CMV前后表达变化进行分析，发现qRT-PCR结果与转录组结果显著相关，相关系数为 0.773 3（图3），由此证明转录组测序数据结果是准确和可靠的。

图3 10个转录因子基因的qRT-PCR及转录组表达量的相关性分析

3 结论与讨论

植物具有独特的免疫系统响应病原物的侵染，其中基础防御通路为病原相关分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP）触发的免疫反应（PTI）（Zatta et al.，2017），更深层的防御方式为病原效应物触发的免疫效应（effector-triggered immuntiy，ETI）。ETI途径往往通过抗病蛋白（resistance proteins）识别病原物的特异效应因子（effectors），当抗病蛋白识别到效应因子后会进入激活态，进而启动病原微生物感染位点的细胞的程序性死亡，有效隔绝病原物的传播。目前研究较多的编码抗病蛋白的基因，主要有在拟南芥上发现的RPM1和RGA1基因，其同源序列在其他植物的基因组中也有报道（Lee et al.，2015；Borgen et al.，2017；Kasmi et al.，2017；王娇 等，2019；Janda et al.，2019）。促分裂原活化蛋白激酶（mitogen actived protein kinase，MAPK）可 将ATP上的磷酸基团转移到底物氨基酸残基上，使其催化磷酸化，而MAPKKK是激活这一过程的关键蛋白。MAPKKK主导的级联反应一方面可以参与激素信号转导以及植物的生长发育进程，同时也是植物抗病反应中的重要组成部分（张振才 等，2014）。

本试验中KEGG通路富集结果发现，相比于茄门，JJ101在接种CMV后，有10个差异基因表现为植物-病原互作功能。其中4个基因为MAPK级联途径的基因，包括2个分裂原活化蛋白激酶MAPK基因和2个促分裂原活化蛋白激酶MAPKKK；2个为类病原相关分子模式所触发的免疫反应蛋白基因PTI；3个基因为抗病蛋白基因，包含2个RPM1和1个RGA1。表明JJ101相比于茄门，在CMV侵染过程中PTI途径、ETI途径和MAPK级联途径异常活跃，综合调动了植物体内免疫系统响应，从而有效地抵抗了病原菌的入侵。这些差异基因的表达与JJ101的抗病性显著相关，这一结果也再次证实了RPM1、RGA1、PTI5、PTI6、MAPK3、MAPK4、MAPKKK1等基因在植物免疫反应中起着十分重要的作用。

研究发现，过氧化物酶可以通过抑制真菌生长和去除H2O2来达到抵抗病原侵染，减轻病害发生的作用。Alcázar等（2010）发现辣椒受到辣椒疫霉侵染后，过氧化物酶活性显著增加，且与辣椒品种的抗病性呈正相关。多酚氧化酶是ETI途径的重要功能蛋白，可将酚氧化为单宁类物质，造成病原菌侵入点细胞的程序性死亡，从而达到阻碍病原扩展的目的（Rosalía et al.，2011）。植物激素信号途径是重要的植物免疫信号系统，目前报道最多的有茉莉酸、乙烯和水杨酸等通路（王妮妍和蒋德安，2002；Birch et al.，2009；Sorokan et al.，2011；Boevink et al.，2016；Kang et al.，2017）。其 中，茉莉酸信号途径在植物抗病反应中发挥着至关重要的作用，茉莉酸可诱导过氧化物酶、多酚氧化酶等防御性酶的合成，与酶活性调节途径串联，从而激活整个植物防御系统（Balaji et al.，2011）。本试验中GO和KEGG通路富集结果发现，相比于茄门，CMV侵染后JJ101有46个差异基因归类为过氧化物酶基因，22个差异基因归类为氧化磷酸化过程，34个差异基因归类为植物激素信号传导通路，说明这些基因在JJ101抵抗CMV侵染的过程中都有重要的表现，是JJ101表现抗病的重要基因。这与前人的研究结果相契合，由此可见JJ101对CMV的免疫是多途径共同作用的过程。除了起主要作用的植物与病原互作的相关通路，还包括多种酶活性调节通路、植物激素抗病信号传导途径在其中贡献力量。这些通路在调控JJ101对CMV的抗性过程中一方面可以独立行使其功能，另一方面还可以互相调动，从而参与到其他途径中共同行使功能。说明JJ101对CMV的抗性并非是由单一基因引起的，而是一个需要大量不同类别、不同途径的基因参与其中的系统性调节过程，这与本试验的转录组分析结果相一致。

本试验通过高通量转录组测序，对茄门和JJ101在接种CMV前后进行了比较深入的转录组学研究，其结果可为在转录水平上全面了解茄门和JJ101对CMV抗性的分子基础提供有价值的见解。通过研究发现，JJ101和茄门抗CMV是一个高度复杂、多途径协同的过程：PTI途径、ETI途径和MAPK级联途径等防御反应在其中起主要作用，酶活性调节、植物激素调节等通路协同作战。研究结果为后期更深入研究辣椒抗病分子机制奠定了基础，为抗病育种提供了理论依据。