范晓蓓，李莲

1 湖北医药学院，湖北十堰442000；2 十堰市人民医院湖北医药学院附属人民医院检验科

近年来，随着碳青霉烯类抗生素的普遍应用，耐碳青霉烯类革兰阴性杆菌逐渐增多。大肠埃希菌是临床最常见的革兰阴性菌，也是临床分离株中仅次于肺炎克雷伯杆菌的第二大耐碳青霉烯类革兰阴性菌［1］。数据显示，近几年耐碳青霉烯类大肠埃希菌（CRECO）的全国平均耐药率较为稳定，但地区之间差异较大，最高耐药率仍不断增加，需要引起重视［2］。研究表明，大肠埃希菌对碳青霉烯类耐药的机制复杂，可能涉及碳青霉烯酶的产生，膜孔蛋白缺失合并产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）、AmpC 酶，以及外排泵或青霉素结合蛋白的高表达等，其中最主要的机制是碳青霉烯酶的产生［3］。耐药基因可能通过克隆传播引起交叉感染，甚至造成爆发流行，导致更高的病死率，给临床治疗和院内感染控制带来了极大困难［1］。目前，治疗产碳青霉烯酶大肠埃希菌造成的感染，可选抗生素种类很少，主要包括多黏菌素、土霉素、福斯夫霉素和氨基糖苷类抗生素，但常因不良反应或治疗的不稳定性导致治疗效果不理想，感染CRECO 的患者病死率日益升高［4-6］。因此，研究CRECO 耐药机制及相关产酶基因型、制定治疗对策己成为刻不容缓的任务。现收集2020 年湖北省十堰市3 家三甲医院的CRECO 菌株，检测产碳青霉烯酶基因型，统计其临床分布情况，并对其同源性进行分析。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源及主要材料 收集自2020 年1 月—12月湖北省十堰市3家三甲医院临床筛选分离得到的31 株CRECO 菌株，来自呼吸道、尿液、血液、分泌物、脓液等样本，排除同一患者的重复标本。低温冻存备用。标本的分离按照《全国检验操作规程》第四版进行。标准菌株大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯杆菌ATCC70063 由国家卫生健康委临检中心提供。哥伦比亚血琼脂、伊红美蓝琼脂、水解酪蛋白（M-H）琼脂、药敏纸片（包括氨苄西林、阿莫西林—克拉维酸、氨苄西林—舒巴坦、哌拉西林—他唑巴坦、头孢唑啉、头孢呋辛、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、头孢西丁、氨曲南、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、复方新诺明）均为英国Oxoid 公司产品。巧克力平板购于郑州安图生物科技有限公司。VITEK-2 Compact 全自动微生物鉴定仪、BACT/ALERT 全自动血液培养仪均购自法国生物梅里埃公司。MALDI-TOF 质谱仪购自布鲁克道尔顿公司。

1.2 菌株耐药性鉴定 将保存的31 株CRECO 菌株复苏，转种培养18~24 h，用MALDI-TOF 质谱仪再次复核是否为大肠埃希菌。用VITEK-2 Compact 全自动细菌鉴定仪对分离培养的大肠埃希菌进行体外药敏试验，采用K-B纸片扩散法和E test条复核药敏结果，并根据美国临床实验室标准化研究所制定的纸片扩散法标准（CLSI2019）对实验结果进行判读。最终得到23 株CRECO 对一种或多种碳青霉烯类药物（如亚胺培南、美罗培南、厄他培南）等中介或耐药，即为此次实验目标菌株。用类似于K-B 纸片法的操作步骤，在MH 琼脂平板上均匀涂布待测菌液。用无菌镊子放置4 张已平衡至室温的亚胺培南药敏纸片，使纸片间距>24 mm，纸片距平板边缘>15 mm，在平板背面对应位置分别标记A、B、C、D。将试剂盒中缓冲液R1（乙二胺四乙酸二钠，氢氧化钠）、R2（3-氨基苯硼酸）平衡至室温，A 纸片作为空白对照，在 B 纸片上滴加 10 μL 的缓冲液 R1，C 纸片上滴加10 μL的缓冲液R2，D纸片上分别滴加10 μL的缓冲液 R1 和 R2。孵育 18~24 h 后取出平板，测量 B、C 纸片抑菌圈直径，分别与A纸片做对比，直径比A纸片扩大≥5 mm，则分别表示该菌株产金属酶、产KPC酶。D纸片抑菌圈与A纸片抑菌圈直径相差≤5 mm，说明该菌株产其他类型酶，或有多种耐药机制共同参与。

1.3 产碳青霉烯基因检测 用煮沸法提取细菌DNA 模板，使用PCR 法检测8 种常见产碳青霉烯基因。由武汉安特捷生物公司合成引物［7-8］，详见表1。反应体系包括：2×Taq Master Mix（12.5 μL），DNA 模板（2 μL），引物1（0.5 μL），引物2（0.5 μL），双蒸水补足反应体积（9.5 μL），总体积共为25 μL。PCR反应结束后，用移液器将8 μL 扩增产物与2 μL 6×Loading Buffer 混合，将 4 μL 混合液和 Marker 分别加入提前配置好的1%的琼脂糖凝胶块的上样孔中，放入电泳槽，调节电压为100 V，电泳40 min，在凝胶紫外成像系统下曝光显影。PCR产物阳性的菌株送由武汉安特捷生物公司测序，结果与NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）对比，确定耐药基因型。

表1 8种常见产碳青霉烯基因PCR扩增引物序列及产物长度

1.4 基因同源性检测 重新设计肠杆菌科基因间重复一致序列（ERIC）上游引物序列5'-ATGTA⁃AGCTCCTGGGGATTCAC-3'，下游引物序列5'-AAG⁃TAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'。反应体系包括：2×Taq Master Mix（12.5 μL），DNA 模板（2 μL），引物 1（1 μL），引物 2（1 μL），双蒸水补足反应体积（8.5 μL），总体积共为25 μL。扩增条件：95 ℃预变性 5 min，95 ℃变性 60 s，52 ℃退火 60 s，65 ℃延伸1 min，共35 个循环，65 ℃最后延伸16 min。产物在1.5%琼脂糖凝胶块中电泳，调节电压为100 V，电泳45 min，在凝胶紫外成像系统下曝光显影。

1.5 统计学方法 采用WHONET5.6 软件对23 株CRECO 中携带碳青霉烯酶基因的菌株分布情况、药敏情况及患者临床资料进行统计。采用SPSS25.0统计软件进行数据处理。

2 结果

2.1 产碳青霉烯基因检测结果 耐药表型检测显示，23 株 CRECO 中，有 14 株 EDTA 协同实验阳性，有6 株APBA 协同实验阳性，3 株协同实验阴性。经PCR 检测，23 株 CRECO 中有 6 株未检测到上述碳青霉烯酶；17株检测到碳青霉烯酶，9株产NDM-5酶，6株产 KPC-2 酶，2 株产 IMP-4 酶。CRECO 的耐药表型和基因型分布见表2。

表2 23株CRECO检出耐药表型和基因型分布（株）

2.2 耐药菌临床分布、耐药情况及感染者特点 采用PCR 扩增方法，最终确定产碳青霉烯酶的17株大肠埃希菌标本来源患者，其中男13 例、女4 例，年龄30~97岁、中位年龄74岁。从科室分布来看，呼吸重症 科 分 离 9 株（52.9%），肾 病 内 科 分 离 3 株（17.6%），重症监护室分离2株（11.8%），在急诊科、伤病疼痛科和血液内科各检出1 株（均占5.9%）。从标本类型来看，呼吸道标本检出7 株（41.2%），其中痰液和支气管灌洗液分别检出5 株（29.4%）和2株（11.8%），分泌物检出4 株（23.5%），尿液和血液检出均为3株（均占17.6%）。17例产碳青霉烯酶大肠埃希菌感染者中，7 例（41.2%）接受机械辅助通气，10 例（58.8%）曾留置导尿管，2 例（11.7%）经历开放性手术操作。住院治疗期间，有12 例（70.6%）患者使用过碳青霉烯类抗生素，9例（52.9%）患者使用过三代或四代头孢治疗，5例（29.4%）患者使用过酶抑制剂类抗生素治疗，有单独用药或联合用药的情况。23 株CRECO 对氨苄西林、阿莫西林－克拉维酸、头孢菌素类（头孢唑啉、头孢呋辛、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、头孢西丁）、氨曲南、碳青霉烯类（亚胺培南、美罗培南）抗生素完全耐药；对β-内酰胺酶类（氨苄西林－舒巴坦、哌拉西林－他唑巴坦）、妥布霉素、氟喹诺酮类（环丙沙星、左氧氟沙星）耐药率很高，分别为94.8%、93.9%、80.2%、96.3%、95.9%；对阿米卡星、庆大霉素、复方新诺明耐药率较低，分别为20.1%、31.7%、29.2%。

2.3 产碳青霉烯基因同源性检测结果 23 株CRECO 的ERIC-PCR 检测结果显示可分为7 种类型，有2 株未扩增出有效条带。11、17、18、19、21、23号菌株属于Ⅰ型；1、3、4、5、8、13、16、20、22号菌株属于Ⅱ型；6 号和 15 号菌株属于Ⅲ型；12、10、9、7 号菌株分别属于Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅵ型、Ⅶ型。结果见图1。

图1 23株CRECO菌株产碳青霉烯基因同源性检测结果

3 讨论

大肠埃希菌是广泛存在于自然界的一种肠杆菌科细菌，主要在胃肠道、生殖道等部位寄生，当人体免疫功能下降时可能致病，引起血液感染、肺部感染、尿路感染等［9］。随着抗生素的广泛应用，无形中筛选、诱导出耐药性越来越强的大肠埃希菌，甚至出现对碳青霉烯类抗生素耐药的情况。耐药菌株导致的感染治疗棘手，延长了患者住院时间，增加患者经济负担，严重影响患者预后。

对临床分离的23 株CRECO，本研究采用EDTA和APBA 与亚胺培南的协同实验来检测KPC 酶和金属酶的产生，有文献报道该法灵敏度和特异度分别为94.8%和100%［10］。我们用PCR 扩增及测序的方法，确定其产碳青霉烯酶的类型，对比发现，6 株APBA协同试验阳性的菌株都检测出KPC-2，表型与基因型100%符合。14 株EDTA 协同实验阳性的菌株，有 9 株检测到 NDM-5，2 株检测到 IMP-4，3 株未检测到金属酶，表型与基因型符合率为78.6%。可见该地区CRECO 耐药机制以产生B类金属酶NDM-5和A类丝氨酸酶KPC-2为主。有研究表明，中国临床环境中的ST167 菌株与blaNDM 基因表达密切相关，特别是具有比blaNDM-1 更高水解活性的blaNDM-5 变体［11］。有学者［11］报告了首次出现的NDM-5，分离自中国北方3 例白血病患者血培养物的CRECO，所有分离株均为ST167。随后，各地检出大肠埃希菌中携带NDM-5 的报道逐渐增多，成为我国CRECO 主要的耐药基因之一。在A 类碳青霉烯酶中最常见的是KPC 酶。有学者在2017 年的调查中发现，90%的多重耐药菌为肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌，产KPC-2 的大肠埃希菌占所有耐药大肠埃希菌的40%，可见KPC-2 已成为中国传播最广泛的碳青霉烯酶［13］。另外还有 3 株 EDTA 协同实验阳性，但PCR 未检出碳青霉烯酶基因的菌株，菌株可能产生此次实验未包含的金属酶或新的金属酶变体。其余3 株协同实验阴性的菌株也未检测到碳青霉烯酶，可能存在其他耐药基因或合并多种耐药机制，如膜孔蛋白缺失合并产ESBLs、AmpC酶，以及外排泵高表达等，需进一步深入研究其耐药机制。

分析患者临床资料发现，产碳青霉烯酶的大肠埃希菌大多从呼吸系统标本中分离出，多数来自呼吸重症病房，大多数为70 岁以上老年患者，且所有患者都经历过机械辅助通气、留置尿管或外科手术等侵入性操作，这些都是住院患者发生CRECO 感染的危险因素［14］。分析临床实际治疗操作发现，一旦遇到多重耐药菌感染或一般用药症状控制不理想时，临床医师首选能广泛覆盖致病菌的三、四代头孢菌素、酶抑制剂类抗生素，有时选择联合用药治疗，而不能严格按照抗菌药物管理要求合理用药；同时部分患者入院即携带多药耐药菌，造成耐药性在不同菌种及不同部位交叉感染，致使CRECO 耐药率逐年增高。该地区23 株CRECO 对大多数抗生素完全耐药，对β-内酰胺酶类抑制剂（氨苄西林－舒巴坦、哌拉西林－他唑巴坦、阿莫西林－克拉维酸）耐药率达90%，对妥布霉素、氟喹诺酮类（环丙沙星、左氧氟沙星）也有超过80%的耐药率，说明该地区CRECO耐药机制复杂，可能涉及多种机制，需要引起高度重视；菌株对阿米卡星、庆大霉素、复方新诺明耐药率相对较低，故对这些药物，临床医生可以参照药敏结果，结合患者情况合理应用。

ERIC-PCR 技术是一种比脉冲场凝胶电泳更容易操作，费用更低廉，兼具高灵敏度和高特异度的同源性检测方法，对控制耐药菌的传播和扩散有重要价值［15］。我们用ERIC-PCR 技术进行同源性检测，结果显示，23 株CRECO 属于7 个不同的克隆型别，未见覆盖本地区的优势型别。Ⅰ型主要分布在C医院，Ⅱ型主要分布在A 医院，B 医院分离的菌株分属不同克隆型。本地区CRECO 存在多种耐药机制，以NDM-5 和 KPC-2 为主，另外还检出 IMP-4 耐药基因型，且可能存在其他耐药机制。本研究未发现本地区的克隆菌株爆发流行，为院内感染防控工作提供了实验室依据。

一直以来，碳青霉烯酶基因的获得被认为是大肠埃希菌对碳青霉烯类抗生素耐药的最常见机制之一［15］。大肠埃希菌耐药基因不仅具有国家分布的特异性，而且在我国不同地区分布也有不同特点［17-18］。近年也有报道同时携带几种不同耐药基因型的大肠埃希菌株［19］。大肠埃希菌本质上对几乎所有临床常用抗菌药物都敏感，但这种细菌具有很强的耐药基因积累能力［19］，产生的碳青霉烯类耐药基因与质粒上的β-内酰胺酶等耐药基因共存，并可以通过水平基因转移。因此，大肠埃希菌既可以从其他细菌获得耐药基因，又可以将其耐药基因传递给其他细菌，造成细菌多重耐药及耐药菌株的广泛传播。对于CRECO 感染的治疗，不仅要继续探索新方法，而且应该加强院内感染管理，合理规范使用抗生素，加强医护人员手卫生意识，避免耐药菌株的交叉传播。