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35味中草药提取物体外抑菌活性的研究

2021-07-20高语

中国民族民间医药·上半月 2021年5期
关键词:药敏试验中草药提取物

高语

【摘 要】 目的:探究35味中草药提取物对14种标准菌株的体外抑菌活性。方法:噻唑蓝(MTT)微量肉汤法测定35味中草药提取物及10种抗菌素对14种标准菌株的90%最低抑菌浓度(MIC90)。其中10味可有效抑菌的中草药提取物经3kDa的超滤离心管筛分为大、小分子后再次测定MIC90。筛选了针对5种常见院内感染菌株(金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌)的增效药物组合。结果:新疆产秦艽、玫瑰、沙棘具有显著的抑菌能力,甘草对革兰氏阳性菌具有强抑菌作用。紫草可抑制白色念珠菌。秦艽可增强头孢他啶对大肠埃希菌的抑菌活性。沙棘可增强氯霉素对铜绿假单胞菌的抑菌活性。千叶蓍可增效多种抗菌素以抑制肺炎克雷伯氏菌。结论:综合评价35味中草药提取物对14种标准菌株的抑菌效果,初步总结了可抑制5种常见院内感染菌株的药物复方。

【关键词】 中草药;提取物;体外抑菌活性;药敏试验;最低抑菌浓度

【中图分类号】R284.2   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517(2021)09-0035-09

地理区位、生态条件独特的新疆维吾尔自治区,蕴藏着丰富、上好的中药材资源[1]。南疆四地州(阿克苏地区、喀什地区、和田地区与克孜勒苏柯尔克孜自治州)冬季温和、日照充足、外贸潜力深厚[2]。近些年来,中草药种植业逐渐成为当地农户增收致富的新途径,展现出良好的经济、社会效益,前景广阔。其中已经达到了一定的种植规模、具有地理标志性的中药材有:和田玫瑰、岳普湖孜然、阿克苏甘草、乌什沙棘、克州红花与叶城紫草。帶动南疆地区中草药种植业的优质、长效发展,需要解决产业链短、附加值低等一系列市场难题。现今,维吾尔民族医药尚缺乏经现代化、规范化研发生产的特色新药品种[3]。新疆深居内陆、气候干燥、人口集中,而抗菌素易积累于稀缺的水资源中[4],故“减抗”、“替抗”刻不容缓、势在必行。研究中草药材的体外抑菌活性,可以在一定程度上帮助疾病防治、新药开发、环境保护与产业规划。

发达的物流加速了优质药材的流动,为民族药剂创新搭建了崭新的平台。全国各族人民在长期实践中发掘的本草、方药[6],扩展了维吾尔医药的科研视野。表1中列出的35味载于《中华本草》、《维吾尔药志》的药材[7-8]。它们或清热解毒,或化痰止咳,或消肿排脓,或祛风解表,或理血固涩,常被用于抗炎、杀菌[9],且疗效确切、基源可靠。

表2中列出的14种标准指示菌在有氧环境中生长良好。其中的革兰氏阳性(G+)球菌S.a、S.p,革兰氏阴性(G-)肠杆菌K.p、E.c与G-非发酵菌P.a、A.b,是临床感染与传播中最常检出的病原菌[10]。L.m、S.t、S.f常见于食源性人畜共患疾病。P.m、S.m、A.f广泛分布于水与土壤中,是重要的条件致病菌。B.s具有典型的芽孢杆菌特征。C.a是常见于顽固的皮肤黏膜感染的真菌。

中草药体外抑菌活性是中医研究的经典课题。早在1947年,徐振氏[11]就进行了400种中草药对4种病原菌的体外抑菌实验。据笔者于2020年10月的查询,中国知网收录的标题中含“中药”与“体外抑菌”的文献已达2651篇。微量增效剂即可大幅提高主方药物的抑菌活性。然而,碍于“试管法”与药敏纸片法程序繁琐,前人的工作大多停留在单方药层次,少见关于药物间增效抑菌的研究。96孔板微量肉汤稀释法操作简便、功能多样、结果可靠。采用此方法,笔者测定35种中草药提取物与10种抗菌素对14种标准指示菌株的MIC90;并在此基础上,进一步测定了10种中草药提取物经超滤离心分离得到的大、小分子的MIC90;筛选出可增效抑菌的药物组合。

1 仪器与材料

1.1 指示菌 K.p、P.a、A.b、S.a、E.c由深圳市呼吸疾病研究所提供,10%甘油冻藏于离心管内。C.a、L.m、B.s、S.p、S.t、P.m、A.f、S.m、S.f购于广东环凯微生物生物技术有限公司,为冻干粉。

1.2 抗菌素 红霉素(ERY)、四环素(TCY)、头孢他啶(CFZ)、卡那霉素(KAN)、万古霉素(VAN)、氯霉素(CHL)、青霉素(PEN)、氧氟沙星(OFX)、多粘菌素B(PB)、美罗培南(MEM)由深圳市呼吸疾病研究所提供。

1.3 中草药 野生人字草、千叶蓍采自喀什市英吾斯坦乡,沙棘、玫瑰、紫草、孜然、甘草、红花为人工栽植品。以上药材经超声清洗后,于干燥箱内烘干。秦艽、伊贝母、洋甘菊、雪莲本草购自新疆伊鼎辉煌生物科技有限公司,为干品。木香、胡黄连30∶1(料液比)提取物购自陕西横岭生物科技有限公司。其余20∶[KG-*3/5]1提取物购自西安金绿生物工程技术有限公司。以上直接购得的提取物均由大宗正品本草经三次75%乙醇提取而成,干粉收率为8%±2%。所有药材标本均保存于喀什大学生命与地理科学学院植物标本室中,经显微形态学鉴定均符合2020年版《中国药典》与以往文献报道中的相关描述。

1.4 试剂 磷酸缓冲盐溶液(PBS)、噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyltetrazolium bromide,MTT,生工生物工程,批号:F411BA0017);龙胆苦苷(成都植标化纯生物技术有限公司);双蒸水(粤戴水处理设备有限公司);

1.5 培养基 阳离子调节MH肉汤(Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth,CAMHB),pH 7.2,大连美仑生物,批号:MB2439-Jul-11D)。LB平板(常德比克曼生物科技有限公司)。

1.6 仪器 IX53倒置显微镜(Olympus);高压蒸汽灭菌器(PHCbi);KH3200DE型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器);XA-1型多功能粉碎机(江苏姜堰市分析仪器厂);ZK-82B真空干燥箱(上海市实验仪器总厂);RE100-Pro旋转蒸发仪(Scilogex);HR40-IIA2型生物安全柜(青岛海尔);Bluepard THZ-100B恒温培养摇床、Bluepard DHP-9031微生物培养箱(上海一恒);Centrifuge 5810R大容量离心机、AG22331 Hamburg紫外可见光分光光度计(Eppendorf);iMark酶标仪(Bio-Rad);JJ224BC型电子天平(G&G);PHS-3C酸度计(成都锐新);075870麦氏比浊管(广东环凯);5mL截留分子量3kDa超滤离心管(PALL);各量程单道、八道移液器(RAININ);

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 提取 将干燥、粉碎、过筛(40目,孔径0.37 mm)的药材粉末称取16 g,置于无纺布袋内,300 mL 60%乙醇70 ℃水浴浸泡2 h。20 kHz超声提取40 min。抽滤除渣。12000 rpm离心3 min。弃沉淀。减压浓缩上清液至稍有固体粉末析出。用双蒸水溶解至10 mL。购得的提取物粉末取1.28 g溶于10 mL双蒸水中。得到生药当量浓度1600 mg/mL的药液。摇匀。加入10 mL 2×CAMHB。得到800 mg/mL药液。测定pH值。配置与35种药液中最低pH值等同的CAMHB培养基(沙棘,pH 3.76)用于阳性对照。800 mg/mL药液用0.22 um微孔滤膜滤过除菌。置于4℃冰箱备用。

2.1.2 菌株 菌株经复苏、复壮后,于CAMHB中37 ℃ 120 r/min振荡培养至对数生长期(OD600 0.6~0.8)。菌液调节至0.5麦氏单位浊度(OD625 0.08~0.13)后,2∶3稀释,使其中含菌1×108 cfu/mL。

2.1.3 微量肉汤稀释法测MIC90 遵照ISO 20776-1[12]、CLSI M07-A10[13]与M27-S4[14]中关于肉汤微量稀释法的操作规范,在96孔微量稀释板中,一列一药,A孔加入各800 mg/mL药液200 μL;B-G孔内加入100 μL CAMHB;A孔吸取100 μL,依次倍比稀释至G孔,弃余液100 μL。使A-G生药当量浓度 (Crude drug equivalent concentration) ck(k=1、2…7)分別为800、400、200、100、50、25、12.5 mg/mL。由于高浓度中药液呈深色,需要在H孔内各加入800 mg/mL药液100 μL作阴性“药液对照”。留未接菌板作“初始对照”。抗菌素药敏试验无需阴性对照。A-H孔抗菌素浓度梯度ck(k=1、2…8)为16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL。如图1所示。

一板一菌。实验组各孔接1 μL 1×108 CFU/mL菌液;使其中最终接菌量为1×106 CFU/mL。第12列A-D孔加入100 μL CAMHB作空白“肉汤对照”。E-H加入100 μL酸性对照培养基,并同上接菌1 μL,作阳性“生长对照”。加盖,37 ℃恒温培养18 h。MTT可被活菌线粒体中的琥珀酸脱氢酶氧化为蓝紫色结晶。96孔内均加入20 μL 5 mg/mL的MTT PBS溶液(初始对照同)。37 ℃避光30 min。测定OD600。

2.1.4 超滤分离 取4 mL 800 mg/mL药液于3 kDa超滤管中离心至完全分离,得到含大、小分子成分的两组子药液。高温高压灭菌后,子药液分别重复前述步骤,测定MIC90。

2.1.5 数据处理方法 各行A-G、H格抑菌率Ik(k=1、2…7、8)(%)=1-[Ok-(On/Osn)×Osk]/(Op-Ob)×100%。Ok:第k孔中的OD值;On:阴性对照孔OD值;Osn:初始对照该列阴性对照OD值;Op:阳性对照孔平均OD值;Ob:空白对照孔平均OD值;Osk:该列初始对照第k孔OD值;满足In(n∈k)>90%的最低cn记为MIC90。2.1.3、2.1.4中每列药-菌试验重复7次,得离散MIC90数列mp(p=1、2…7)。取mp中的众数记录。

2.1.6 抗菌增效药物组合的筛选 ①制备“增效剂库”。取一96孔板,1-5、7-11列前35孔依药材编号次序加入200 μL 800mg/mL的中药液,5、11两列后5孔加入10种200 μL 16 μg/mL抗菌素,6、12列加入200 μL CAMHB。  ②制备“实验板”。“增效剂库”各孔取2 μL对应加入空白96孔板后,在第该板1-5、7-11列加入98 μL 1/2 MIC90主方的接菌肉汤(空白对照加入等量无菌无药CAMHB肉汤),6、12列加入98 μL CAMHB。“实验板”加盖,37 ℃培养18 h后,加入MTT。判定清亮孔中的药物组合增效抑菌作用为显著。

2.1.7 棋盘法药物联用将两种抗菌药物倍比稀释为8个浓度梯度。按A-G、8-1浓度递减顺序,各取50 μL两两组合加入96孔平板中,得到每孔100 μL的8×8棋盘矩阵。遵照2.1.3中的方案,9、10列照作两种药物的MIC实验;剩余孔作阴性、阳性、空白对照。留未接菌板作初始对照。

2.2 结果

2.2.1 中草药提取物对标准指示菌株实验中所有空白、阴性对照孔均清亮,阳性对照孔呈深蓝紫色; CLSI M100[15]中涉及到的标准株均为敏感;实验处于正常状态。由表3、4可知,玫瑰对于除C.a外的13种指示菌,秦艽对B.s、E.c、S.f、K.p、A.b,沙棘对P.a,千叶蓍对S.p、K.p和A.b,胡黄连对S.a和A.b,骆驼篷子与红花对E.c,人字草、岩白菜与甘草对S.a,骆驼蓬子与甘草对S.p,薄荷对S.a、P.a,具有较强的抑菌作用。甘草对G+细菌的抑菌活性高于G-细菌。只有紫草、薄荷可以抑制C.a。

2.2.2 10种中草药提取液经筛分后成分的结果 选取云南产胡黄连,西藏产岩白菜,新疆产秦艽、沙棘、千叶蓍、人字草、玫瑰、骆驼蓬子、红花、甘草10种中草药液超滤分离。因各子药液体积均不低于原药液的1/3,其生药当量浓度记为800 mg/mL。由表5可知,千叶蓍抗S.p时的活性的物质为3000 Da以下小分子,抗S.t时大、小分子的MIC90等同于未经超滤离心分离的原药液。沙棘在抗P.a、E.c时,大、小分子的MIC90也与原药液相同。秦艽、胡黄连、人字草在抑制S.a等菌时的活性物质为3000Da以上大分子。以龙胆苦苷为代表的裂环环烯醚萜类常被认为是秦艽的特征成分。本实验证实,4 mg/mL的龙胆苦苷对E.c、A.b无抑菌活性。玫瑰(图2.1)、骆驼蓬子、红花、甘草的大、小分子普遍具有协同抑菌作用。人字草的小分子虽然无法直接抑制S.a,但是可以增强其大分子的抑菌能力(图2.2)。岩白菜提取物中的大、小分子在抑制S.a、P.a、E.c时有协同作用,而在抑制A.b时,则大、小分子拮抗。这表明,中草药抑菌是多靶点的。针对不同的菌株,中草药成分的药效作用机制不同。

2.2.3 抗菌增效药物组合 秦艽、柴胡、甘草是常用于治疗发热与上呼吸道感染的复方搭配。秦艽可显著增效头孢他啶对大肠埃希菌的抑菌活性(图2.3);50%抑菌折点为CFZ 0.125 μg/mL、秦艽12.5 mg/mL。CFZ抑制转肽酶在细菌细胞壁形成过程中的转肽作用。牛俊瑞[30]的研究指出,破坏生物膜可有效抑制E.c,且只有当头孢他啶与黄芩等中药提取物的浓度均达到一定阈值时,联合用药才可有效抑菌。此结果与本实验图2.3中明显的横、纵分界线吻合,提示秦艽增效CFZ的抑菌机制可能与破坏E.c的生物膜相关。黏肽合成酶PBP1b是亚-MIC CFZ抑制E.c生物膜形成的主要靶点[31]。童丽艳[32]使用计算机辅助分子对接技术,从104万个化合物中筛选出的4种作用于PBP1b的先导化合物,均具有苯磺酸基团结构,分子量在275~425 Da之间,对E.c、L.m、B.s、S.a、P.a的MIC为175~225 μg/mL。然而,龙胆科植物化学成分中未见此类化合物的报导。秦艽中增效CFZ的化学成分,有待进一步发掘研究。

沙棘可增效CHL、OFX抑制铜绿假单胞菌;50%抑菌折点分别为CHL 8 μg/mL、沙棘6.25 mg/mL与OFX 1 μg/mL、沙棘25 mg/mL。铜绿假单胞菌在呼吸系统感染中最为常见,是呼吸机相关性肺炎的重要病原菌。在沙棘浓度为25 mg/mL时,CHL对P.a的90%最小抑菌浓度可由单用时的16 μg/mL降低至4 μg/mL。CHL通过干扰tRNA结合在在细菌70S核糖体50S亚基上,抑制蛋白质合成。OFX抑制细菌DNA旋转酶的活性而阻止细菌DNA的合成和复制。戴晓天[33]发现,酸性环境抑制P.a的生长与生物膜的生成,并降低P.a蛋白水解酶的分泌;OFX抑制P.a活性随Ph的增高而降低。于是,笔者将沙棘药液Ph调节至7.2再次测试,发现其对OFX的增效作用略微减弱,而对CHL的增效作用无变化(图2.4)。见表6。

千叶蓍耐脊薄、干旱,易于栽培,与薄荷、独活、柴胡等多种药物联用时可以有效抑制P.a与A.b。而现今,千叶蓍在南疆地区仍然鲜有栽植。

3 讨论

抗菌素的广泛使用,在有效地控制细菌感染的同时,造成了不同程的残留和耐药性后果。中药以其毒副作用小、无残留、不易产生抗药性等诸多优势,愈加受到科研工作者的重视。各地中药材的研究,都为民族医药的现代化研发提供了参照。据报导,鞣质为500 Da以上的水溶性酚类化合物,存在于70%以上的植物药中,与许多药物的抑菌活性有关[31];玫瑰中芳香类与多酚类[23-32],沙棘果中的黄酮、多糖[33-34],异甘草素对于G+菌[35],具有较强的抑菌活性。近20年来,尽管分子水平的中草药化合物研究已全面展开,千叶蓍、骆驼蓬子等新疆常见中药材中的化合物的分子作用机制尚不明确,有待进一步研究。

本实验研究了35种中草药对细菌的体外抑菌活性,得到的各MIC90值与文献中记载的研究成果大致相似。但是,由于药品品种、产地、提取工艺的差异,部分结果稍有不同。分级抑菌浓度结果(图2.3~2.4)证明了中药联用可减少抗菌素的用量。与化学特征显著的现代抗菌素“药物”理念不同的是,民族民间医学主张通过调节人体的“气质”,从整体上提高机体的免疫力,以实现病灶的清除。受制于样本来源单一、“南橘北枳”、未进行动物实验,本实验究仍然具有一定的局限性,有待后续研究予以加强。

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(收稿日期:2020-10-20 编辑:程鹏飞)

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