陈国晶,杨 宁,吴文静,喻 静,金磊磊,张爱华,陈集双

(1.南京工业大学 生物与制药工程学院,江苏 南京 211800;2.河海大学 海洋学院,江苏 南京 210098)

紫杉醇(商品名taxol)是一种广谱、天然的抗癌药物。最早是由Wani等[1]从太平洋短叶红豆杉树皮中分离提取得到的一种四环二萜类化合物,它作为一种天然的次生代谢产物,经过临床验证,对多种癌症有着很好的疗效,并被广泛应用于卵巢癌、乳腺癌、肺癌等的治疗[2]。目前,紫杉醇已经在60多个国家临床应用,被认为是对卵巢癌最有效的天然抗癌药物之一[3]。

迄今为止的研究和产业实践中,紫杉醇主要从红豆杉树皮或树叶中直接提取,但是红豆杉树干皮和根部皮的紫杉醇平均质量分数仅为0.029 4%和0.031 1%[4],提取300 kg的紫杉醇需要砍伐50～60年生的红豆杉树40～80万株,以目前的提取方式和市场需求量,单依靠从红豆杉树中提取紫杉醇已经严重危害到了红豆杉的自然生长,对野生红豆杉资源也造成了极大的破坏。利用微生物来生产生物活性物质,则可采用发酵罐大规模生产且具有可重复性、发酵技术简单、易操作、生产时间短和成本低等优点[5-6]。但目前已知的微生物发酵产紫杉醇的含量很低,并不能达到产业化的要求(产率仅高于 1 mg/L)[7],需要进行一系列的优化改良,主要集中在以下几个方面:从自然界中筛选高产紫杉醇菌株、利用诱变育种技术进行菌种改良、优化培养基的组成、优化发酵条件和人工代谢调控[8]。

目前,研究者从红豆杉植株中分离了大量的内生真菌,并筛选到了产紫杉醇的菌株。Soca-Chafre等[9]从球果红豆杉中分离得到1株能够产0.065～0.250 μg/L紫杉醇的内生真菌。田仁鹏等[10]从南方红豆杉树中分离出1株产紫杉醇的内生真菌,其产物中紫杉醇质量浓度为84.5 μg/L。红豆杉内生真菌中紫杉醇的含量均偏低,不利于内生真菌工业化发酵产紫杉醇。近年来一些研究表明,通过优化发酵条件可以提高内生真菌发酵产紫杉醇含量,在发酵过程中添加生物或非生物诱导子是促进紫杉醇合成的有效途径之一[11]。紫杉醇合成过程中的三环二萜骨架来自甲瓦龙酸途径,C13侧链来自苯丙氨酸,向培养基中添加该前体物质能够增加紫杉醇的生物合成量[8]。陈文强等[12]在红豆杉内生真菌液体发酵时添加水杨酸,内生真菌中紫杉醇的质量浓度为604.0 μg/L。Salehi等[13]向发酵培养基中添加欧洲榛子悬浮细胞提取物和细胞培养液,使得内生真菌产紫杉醇的含量提高了44%。

笔者选取1株分离自曼地亚红豆杉树皮的产紫杉醇内生真菌MF5,通过添加不同的生物/非生物诱导子诱导真菌发酵产紫杉醇的能力,建立内生真菌MF5发酵产紫杉醇的技术方案,为后期的扩大发酵和工业化制备紫杉醇奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

链格孢属(Alternariasp.)内生真菌MF5,笔者所在实验室保存；CuSO4,上海新宝精细化工厂;茉莉酸甲酯(MeJA),美国阿拉丁公司;赤霉素(GA3),毕得医药公司;红豆杉浸出液、紫杉醇标准品,美国Sigma公司;其他试剂均为国产色谱纯或分析纯。

1.2 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):马铃薯100 g,加去离子水煮熟,经纱布过滤取滤液,用去离子水定容至500 mL,加葡萄糖、琼脂各10 g,热溶于马铃薯滤液中,高温灭菌备用。

马铃薯葡萄糖培养基(PD):马铃薯100 g,加去离子水煮熟,经纱布过滤后取滤液,用去离子水定容至500 mL,加葡萄糖10 g,高温灭菌备用。

1.3 内生真菌的活化

将保存于4 ℃冰箱内的菌种MF5接种至新的PDA培养基上,于28 ℃下恒温培养5 d,以激活菌株生长活力,用于后续发酵实验。

1.4 发酵培养

活化后的菌株MF5,分别接种至PD培养基、添加不同浓度红豆杉浸出液的PD培养基、添加3种诱导子(MeJA、GA3、CuSO4)的PD培养基、添加诱导子+红豆杉浸出液的PD培养基中,接种量为每100 mL 培养基接种5块菌饼(5 mm×5 mm),在28 ℃、120 r/min条件下恒温振荡培养15 d,进行紫杉醇含量检测。

1.5 紫杉醇的提取与检测

MF5内生真菌中紫杉醇的提取与检测参照文献[14]的方法。①待测菌株发酵液的处理:取50 mL发酵液,加入双倍体积的乙酸乙酯,充分振荡混匀,于分液漏斗中静置10 min,取乙酸乙酯层(上层)40 mL,45 ℃旋转蒸发干,取5 mL 甲醇溶解,用0.22 μm的有机微孔滤膜过滤,待测。②高效液相色谱(HPLC)分析条件:色谱仪为Agilent Technol-ogies 1200型,色谱柱选用Innoval AQ C18型色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流速0.8 mL/min,检测波长227 nm,柱温30 ℃,流动相V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=40∶25∶35,进样量10 μL。③液相色谱-质谱联用分析(LC-MS分析):部分样品送至南京大学分析检测平台进行LC-MS分析。④标准曲线绘制:准确称取0.001 g的紫杉醇标准品,用甲醇溶解并定容至10 mL,配制成100 mg/L的母液,然后依次稀释成质量浓度为20、40、60、80和100 mg/L的标准品溶液,分别过0.22 μm的有机微孔滤膜,待测。每份标准溶液进行3次检测,每次进样10 μL,分别以溶液质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标,建立线性回归方程并绘制标准曲线。

2 结果与分析

2.1 菌株MF5菌落形态

菌株MF5经过纯化后菌落表面菌丝呈灰色,外围新生菌丝形成白色外圈,菌丝蓬松呈毛绒状(图1(a))。分生孢子呈倒棍状,褐色,具有横膈膜,少数有纵隔膜,隔膜处稍有缢缩,孢子大小为(11.68～33.35) μm×(5.61～9.19) μm(图1(b))。

图1 菌株MF5的菌落和孢子形态Fig.1 Colonial morphology and conidia spores of strain MF5

2.2 菌株MF5中紫杉醇的检测结果分析

2.2.1 HPLC分析

图2为紫杉醇的HPLC图谱。由图2可知:菌株MF5的PD发酵培养样品的出峰时间与紫杉醇标准品基本一致,均在14.6 min左右,表明检出物应是同一种物质,初步得出内生真菌MF5是产紫杉醇的。

图2 紫杉醇标准品和菌株MF5发酵培养样品的HPLC图谱Fig.2 HPLC spectra of paclitaxel standard and strain MF5 fermentation culture sample

2.2.2 LC-MS分析

图3为紫杉醇标准品和菌株MF5发酵培养样品的质谱。由图3可看出紫杉醇标准品产生了1个质荷比(m/z)为876.317 5的M+/Na+离子峰,而真菌发酵液样品中也检测到同一质荷比的离子峰,由此证实内生真菌MF5可生物合成紫杉醇。

图3 紫杉醇标准品和菌株MF5发酵培养样品的质谱Fig.3 Mass spectra of paclitaxel standards and strain MF5 fermentation culture sample

2.2.3 红豆杉浸出液对MF5产紫杉醇的影响

向PD培养基中加入红豆杉浸出液,发酵15 d后,通过HPLC检测紫杉醇浓度,结果如表1所示。由表1可见:本试验在添加不同浓度红豆杉浸出液时,检测结果与对照组有很大的差别,总体来说,浸出液都能够促进内生真菌产紫杉醇。在添加1%和2%低质量分数的红豆杉浸出液时,发酵液中紫杉醇的浓度与对照组相比有小幅度的增加;在添加4%红豆杉浸出液时,发酵液中紫杉醇质量浓度达到(2.47±0.07) mg/L;添加8%高质量分数的红豆杉浸出液时,发酵液中紫杉醇的浓度有小幅度的下降,跟对照组相比紫杉醇的浓度还是有所提高。红豆杉的树皮或树叶中含有紫杉醇合成的前体物质。查冲等[15]研究发现,红豆杉树叶中存在10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ), 10-DABⅢ是紫杉醇的前体,推测红豆杉浸出液提高内生真菌产紫杉醇能力的原因可能是发酵过程中该前体转化成了紫杉醇。El-Bialy等[16]在内生真菌培养基中加入碾碎的欧洲红豆杉树皮,发现紫杉醇产量比对照组高出4倍。结合本试验结果,进一步证实了在发酵过程中添加红豆杉浸出液能够有效地增加紫杉醇产量。

表1 红豆杉浸出液浓度对MF5产紫杉醇含量的影响Table 1 Effects of the concentration of yew crude extracts on the production of paclitaxel by MF5 strains

2.2.4 诱导子、红豆杉浸出液对MF5产紫杉醇的影响

在上述实验的基础上,本试验选取了MeJA、GA3、CuSO43种诱导子刺激真菌产紫杉醇。前人研究表明MeJA可激活特定防御基因的转录和翻译,从而促进次生代谢产物的合成,是一种非常有效的诱导子[17]。GA3作为一种代谢抑制剂,能够抑制与紫杉醇合成无关的次级代谢途径,为紫杉醇的合成提供更多的基础物质,从而提高紫杉醇的合成量[17]。Cu2+是一种重金属诱导子,在低浓度添加时,会提高微生物次级代谢产物的合成[18]。

通过向PD培养基中添加上述3种诱导子及4%红豆杉浸出液,混合、发酵15 d后检测真菌发酵液中的紫杉醇含量,结果如表2所示。3种非生物诱导子和红豆杉浸出液混合添加对MF5产紫杉醇含量都有着明显的影响。单独添加3种诱导子到PD发酵培养基时,MF5中紫杉醇的浓度较对照组有小幅度上升,其中单独添加MeJA时效果最佳,检测到的紫杉醇质量浓度最高,达到了(0.83±0.21) mg/L；添加CuSO4时效果最差,检测到紫杉醇的质量浓度只有(0.43±0.08) mg/L;向发酵培养基中添加3种诱导子和4%红豆杉浸出液,MF5中紫杉醇的质量浓度达到(12.58±0.08) mg/L,为对照组的39.31倍,是目前已知产紫杉醇最高菌株(1.12 mg/L)[19]的11.23倍左右。

表2 诱导子和红豆杉浸出液对MF5发酵产紫杉醇的影响Table 2 Effects of elicitors and yew crude extracts on the production of paclitaxel by MF5 strains

3 结论

本研究利用HPLC和MS分析确定了红豆杉内生真菌MF5具备产紫杉醇的能力。在发酵过程中添加红豆杉浸出液以及MeJA、GA3和CuSO4化学诱导子方式,探究了诱导子对微生物发酵产紫杉醇的影响。

试验表明,添加一定浓度的诱导子和红豆杉浸出液均能促进内生真菌MF5产紫杉醇的能力。向PD发酵培养基中添加4%红豆杉浸出液,提高了内生真菌MF5产紫杉醇能力,含量达到(2.47±0.07) mg/L。同时,在PD发酵培养基中添加红豆杉浸出液、MeJA、GA3和CuSO4诱导子组合,能够明显提高内生真菌发酵产紫杉醇的含量,紫杉醇质量浓度达到(12.58±0.80) mg/L,高于目前报道的微生物发酵产紫杉醇水平。因此,本研究结果证实内生真菌MF5具备规模化制备紫杉醇的潜力。