张敏 刘惠娟 王永福 石岩

摘要 摘要[目的]建立一测多评法同时测定淫羊藿中6种黄酮类成分的方法，并对甘肃地区的21批药材进行定量分析。[方法]Agilent Zorbax色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为水（A）、乙腈（B），梯度洗脱，流速0.8 mL/min，检测波长270 nm，进样量10 μL。分别考察不同条件对相对校正因子的影响。评价一测多评法和标准曲线法在含量测定结果上的差异。[结果]建立了以淫羊藿苷为内标参照物，同时测定6种黄酮类成分的一测多评法。不同条件下相对校正因子的RSD小于2.63%。多点矫正-一测多评法、斜率矫正-一测多评法和标准曲线法测定21批甘肃地区淫羊藿样品含量，其RSD小于3%，无明显差异。[结论]一测多评法结果准确、操作简单易行，可用于淫羊藿中黄酮类成分的含量测定。

关键词 一测多评;淫羊藿;黄酮类成分;含量测定;甘肃地区

中图分类号 R-284.1文献标识码 A文章编号 0517-6611（2021）11-0182-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.11.049

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Determination of Flavonoids of Epimedium in Gansu by Quantitative Analysis of Multi-components with a Single Marker（QAMS）

ZHANG Min1， LIU Hui-juan1， WANG Yong-fu2 et al

（1.Gansu Medical College， Pingliang，Gansu 744000;2.Gansu Digital Herbal Testing Center Co.， Ltd.， Dingxi，Gansu 743000）

Abstract [Objective]To establish a method for simultaneous determination of 6 flavonoids in Epimedium by QAMS， and to determine the content of 21 batches of medicinal materials in Gansu Province. [Method]Agilent Zorbax column （4.6 mm×250 mm， 5 μm）， mobile phase were water （A） and acetonitrile （B）， gradient elution， flow rate was 0.8 mL/min， the detection wavelength was set at 270 nm， injection volume 10 μL.The effects of different conditions on relative correction factors were investigated.The difference between the standard curve method and QAMS was evaluated in content determination. [Result] A method was established to determine 6 flavonoids by using icariin as internal reference based on QAMS.The RSD under different conditions was less than 2.63%. The content of 21 batches of Epimedium in Gansu Province was determined by QAMS and standard curve method， the RSD of two sets was less than 3% and there was no significant difference. [Conclusion] QAMS is accurate， easy to operate， and can be used to determine the content of flavonoids in Epimedium.

Key words QAMS;Epimedium;Flavonoids;Content determination;Gansu area

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim.、箭叶淫羊藿Epimedium sagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxim.或朝鲜淫羊藿Epimedium koreanum Nakai的干燥叶[1]，其基源复杂、分布广泛、质量差别大[2]。而甘肃地区的淫羊藿质量一直为市场所认可[3]。

淫羊藿的主要药效成分为黄酮类，国内外大量研究都集中在此类成分研究上[4-5]。2015版《中国药典》以淫羊藿苷≥0.5%作为含量合格的指标，造成市面上多数药材质量不合格[6]。现代研究表明，淫羊藿中具有生理活性的成分不局限在淫羊藿苷。朝藿定C抗骨质疏松效果明显，宝霍苷I对鼻咽癌、口腔上皮癌有作用[7-8]。因此，全面考察淫羊藿中黄酮类成分，才能科学地反映药材质量。

一测多评法（QAMS）近年来被广泛应用于中药多种成分的定量分析中[9-11]。该法基于各成分之间的函数关系，选择一种价廉易得的内标参照物，同时测定其他多种成分，操作成本低，应用广泛[12]。笔者以淫羊藿苷为内标参照物，分别测定朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和宝霍苷I的相对校正因子，考察不同条件下的耐用性，建立一测多评法;在此基础上，采用一测多评法和标准曲线法定量分析甘肃地区21批淫羊藿样品，比较测定结果的差异，评价黄酮类成分的含量，为甘肃地区淫羊藿质量评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象。该试验所使用的淫羊藿药材来自甘肃数字本草检验中心有限公司。经甘肃医学院生药学教研室鉴定均为淫羊藿种属淫羊藿。

1.1.2 主要仪器。高效液相色谱仪为Agilent 1260（配置DAD检测器，美国Agilent公司），Agilent Zorbax色谱柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）;KQ-50DE超声波提取仪（昆山市超声仪器有限公司）;CAP225D电子天平（十万分之一，德国Sartorial公司）;超纯水系统（Merck Millipore公司）。

1.1.3

主要试剂。乙腈、甲醇为色谱纯，德国Merck公司;乙醇为分析纯，南京奥佳化工有限公司;朝藿定A1（批号P02J9S64790）、朝藿定A（批号P02J9F64787）、朝藿定B（批号P02J9A64781）、朝藿定C（批号P02J9D65890）、淫羊藿苷（批号T05D9B76755）、宝霍苷Ⅰ（批号T05S65007）为对照品，上海叶源生物科技有限公司，纯度均在98%以上。

1.2 方法

1.2.1

对照品溶液的制备。分别精密称取朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和宝霍苷Ⅰ适量，加甲醇制成混合对照品溶液，相应的浓度为51.50、107.03、250.10、257.54、309.04和10.82 μg/mL。

1.2.2

供试品溶液的制备。取淫羊藿粉末（过3号筛）约0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，精密称取重量，超声处理30 min，放冷至室温。再次称定重量，用70%乙醇补足失重，摇匀。用0.45 μm微孔有机滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

1.2.3

色谱分析条件。Agilent Zorbax色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为水（A）、乙腈（B），梯度洗脱（0～25 min，21%～30%B;25～35 min，30%～70%B;35～45 min，70%～90%B;45～50 min，90%B），流速0.8 mL/min，柱温30 ℃，检测波长270 nm，进样量10 μL。

1.2.4 方法学考察。

1.2.4.1

线性关系的考察。取“1.2.1”对照品溶液制备项下的混合对照品溶液，对半稀释法稀释6次，得到不同浓度的对照品溶液。按照“1.2.3”色谱条件进行测试，每个点平行3次。以平均峰面积（Y）为纵坐标、对照品浓度（X，μg/mL）为横坐标绘制标准曲线。

1.2.4.2 稳定性试验。精密称取1号样品，按照“1.2.2”供试品溶液制备方法处理。分别在0、2、4、8、12、24、48 h进样分析，记录朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和宝霍苷Ⅰ的峰面积，并计算RSD。

1.2.4.3

精密度试验。取1号样品，按照“1.2.2”供试品溶液制备方法处理，“1.2.3”色谱条件分析，连续进样6次，記录朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和宝霍苷Ⅰ的峰面积，并计算RSD。

1.2.4.4

重复性试验。取1号样品6份，按照“1.2.2”供试品溶液制备方法处理，“1.2.3”色谱条件分析，计算朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和宝霍苷Ⅰ的含量，并计算RSD。

1.2.4.5

加样回收试验。精密称取已知含量淫羊藿样品6份（1号样品），分别加入混合对照液适量，按照“1.2.2”供试品溶液制备方法处理，“1.2.3”色谱条件分析，测定朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和宝霍苷Ⅰ的含量，计算加样回收率。

1.2.5 相对校正因子和相对保留时间的计算。

1.2.5.1

多点矫正法计算相对校正因子。取“1.2.4.1”项下的系列混合对照品溶液，进样分析。以淫羊藿苷为内标参照物，利用公式fsk=fsfk=As/CsAk/Ck计算相对校正因子fsk。其中，As为内标参照物的峰面积，Cs为内标参照物的浓度，Ak为被测物的峰面积，Ck为被测物的浓度。

1.2.5.2

斜率矫正法计算相对校正因子。通过标准曲线方程计算斜率之比，即fsk=αs/αk，其中，αs为内标参照物的斜率，αk为待测成分的斜率。

1.2.5.3

相对保留时间的计算。利用公式Rks=tRk/tRs计算相对保留时间Rks，其中tRk为其他组分保留时间，tRs为参照物保留时间。

1.2.6

耐用性考察。考察3种不同仪器（Agilent1260、岛津LC2010A、Waters 2695）、色谱柱（Agilent Zorbax C18色谱柱、岛津Wondasil C18色谱柱、Waters SunFire C18色谱柱）、流速（0.8、0.9、1.0 mL/min）、柱温（25、30、35 ℃）和进样体积（5、10、20 μL）对相对校正因子的影响，并计算不同条件下相对校正因子RSD。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 对照品和供试品溶液色谱图。图1表明，在“1.2.3”色谱条件下，样品中各成分的保留时间与对照品色谱图中的一致，分离度大于1.5，满足要求。说明此色谱条件适合测定淫羊藿中朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和宝霍苷Ⅰ的含量。

2.1.2 线性关系的考察。以朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和宝霍苷Ⅰ的浓度对峰面积进行线性回归，得到回归方程及相关系数，结果如表1所示。表1表明各成分对照品浓度与峰面积线性关系良好。

2.1.3 稳定性试验。按照“1.2.4.2”方法操作，计算得出朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和宝霍苷Ⅰ的峰面积RSD分别为0.77%、1.21%、0.98%、1.06%、0.86%和1.34%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.1.4 精密度试验。按照“1.2.4.3”方法操作，计算得出朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝霍苷Ⅰ的峰面积RSD为0.36%、0.21%、0.31%、0.45%、0.28%和0.75%，表明仪器精密度良好。

2.1.5 重复性试验。按照“1.2.4.4”方法操作，测得朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝霍苷Ⅰ的含量RSD分别为1.27%、0.95%、1.28%、1.07%、1.34%和1.52%，表明该方法的重复性良好。

2.1.6 加样回收试验。按照“1.2.4.5”方法操作，计算加样回收率在98.45%～102.33%，RSD均小于3%，说明回收率良好，方法可行。

2.2 相对较正因子和保留时间的计算

2.2.1 多点矫正法计算校正因子。按照“1.2.5.1”方法操作，以淫羊藿苷为参照物，计算朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和宝霍苷Ⅰ的相对校正因子fsk值分别为1.416 7、1.327 8、1.257 1、1.226 9、0.687 2，RSD分别为2.86%、2.51%、2.99%、2.66%、1.87%。

2.2.2 斜率矫正法计算相对校正因子。按照“1.2.5.2”方法操作，计算出朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和宝霍苷Ⅰ的相对校正因子fsk值分别为1.419 7、1.325 2、1.253 3、1.227 6、0.686 7。

2.2.3 相对保留时间的计算。按照“1.2.5.3”方法操作，以淫羊藿苷為内标参照物，计算朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和宝霍苷Ⅰ的相对保留时间分别为0.81、0.86、0.90、0.94、1.59。

2.3 耐用性考察

按照“1.2.6”方法操作，不同仪器、色谱柱、流速、柱温、进样体积条件下测得的相对校正因子如表2所示。结果显示，朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和宝霍苷Ⅰ的RSD分别为0.53%、1.27%、0.60%、0.55%、2.63%，表明方法的耐用性良好。

2.4 含量测定

取21批甘肃产淫羊藿样品，按照“1.2.2”方法处理，按“1.2.3”色谱条件进行HPLC分析。采用标准曲线法、多点矫正-一测多评法（MPC-QAMS）和斜率矫正-一侧多评法（SC-QAMS）分别计算6个黄酮类成分含量，具体数据见表3。结果显示三者RSD均小于3%，说明3种方法不存在明显差异。一测多评法相比来说操作简单、成本低廉，具有优势。

按照多点矫正-一测多评法的含量测定结果，计算21批样品6个黄酮类成分总量，具体数据见表3。结果显示（表3），甘肃地区淫羊藿中总黄酮除8号样品外，其余均大于1.5%。其中，含量排在前5的淫羊藿依次为11号、3号、7号、12号、10号，分别来自甘肃迭部、甘肃西和县、甘肃岷县、甘肃武山县和甘肃成县。

3 讨论与结论

该研究以淫羊藿苷为内标参照物，建立了一测多评法同时测定淫羊藿中6种黄酮类成分的方法。淫羊藿苷在淫羊藿药材中含量高且稳定，对照品价廉易得，选为内标参照物。朝藿定类对奥沙利铂损伤的周围神经具有明显的保护作用[13]。宝霍苷I是淫羊藿苷在体内的水解产物[14]，故选取朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、宝霍苷I作为测试目标。

多点矫正-一测多评法和斜率矫正-一测多评法二者测定的相对校正因子基本一致。前者方法的使用率更高[12]。故该研究采用多点矫正-一测多评法进行耐用性考察及6个黄酮类成分的总量计算。色谱峰定位的常见方法有时间差法和相对保留时间法。时间差法在不同的仪器和色谱柱上会有较大的波动[15]。相对保留时间法适用于定位与参照物性质类似的成分。淫羊藿的黄酮类成分是以2-苯基色原酮为母核的衍生物[16]，所以采用其定位色谱峰，效果良好。

甘肃为淫羊藿的重要产区之一。不同产地的药材品质相差较大。该研究结果表明，甘肃迭部、甘肃西和县、甘肃岷县、甘肃武山县和甘肃成县出产的淫羊藿，所测6个黄酮类成分的含量总量较高。

参考文献

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2015年版 一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：327.

[2] 郭宝林，黄文华，孙娥，等.淫羊藿药材和饮片市场调查[J].中国中药杂志，2010，35（13）：1687-1690.

[3] 裴利宽，黄文华，何天谷，等.中药淫羊藿主要资源种类药材质量的系统研究[J].中国中药杂志，2007，32（21）：2217-2222.

[4] 袁航，曹树萍，陈抒云，等.淫羊藿的化学成分及质量控制研究进展[J].中草药，2014，45（24）：3630-3640.

[5] 李艳，于涛，苗明三.淫羊藿的化学、药理与临床应用分析[J].中医学报，2017，32（4）：619-622.

[6] 刁红雨，孙冬梅，王维礼.51批淫羊藿质量分析[J].中国社区医师，2017，33（12）：20-21，23.

[7] 刘亚林，黄觅，冯晶，等.基于Micro-CT技术分析淫羊藿苷和朝藿定C对糖皮质激素性骨质疏松症小鼠骨组织微结构的影响[J].药物评价研究，2020，43（9）：1733-1739.

[8] 林新，李文魁，罗崇念，等.淫羊藿次甙 II 对三种肿瘤细胞株增殖的抑制作用[J].中国药理学与毒理学杂志，1997，11（3）：183.

[9] 王福成，李冬华，郭文宾，等.HPLC-DAD法同时测定栀子金花丸中10个成分的含量[J].药物分析杂志，2020，40（1）：145-154.

[10] 高喜梅，池玉梅，张雯，等.指纹图谱结合一测多评法评价酸橙枳实质量的研究[J].中草药，2020，51（9）：2548-2556.

[11] 张洪坤，郭长达，杨美华，等.一测多评法测定白芍中3种芍药苷类成分的含量[J].安徽农业科学，2020，48（15）：211-215，221.

[12] 陈杨，徐光临，徐德生，等.一测多评法在中药质量控制中的应用及关键问题[J].环球中医药，2017，10（5）：635-640.

[13] 兰海，刘欣妍，余玲，等.大孔树脂纯化淫羊藿中朝藿定与淫羊藿苷工艺研究[J].中草药，2020，51（17）：4473-4481.

[14] 钱浅，孙娥，樊宏伟，等.羊脂油对淫羊藿炮制品提取物中宝藿苷Ⅰ在大鼠体内药动学特征的影响[J].中草药，2012，43（10）：1981-1985.

[15] 张丽先，范毅，魏悦，等.一测多评法同时测定野菊花中12个成分[J].药物分析杂志，2020，40（2）：218-226.

[16] 秦伟瀚，阳勇，郭延垒，等.基于巫藿苷为主要代谢产物的生源途径推导及淫羊藿新化合物鉴定分析研究[J].天然产物研究与开发，2020，32（9）：1529-1538，1575.