徐 琼刘建浩王天磊谭春凤

(三亚市中医院针灸科,海南三亚 572000)

随着社会老龄化进程,脑血管疾病发病率呈逐年攀升态势,其中缺血性脑血管疾病发病率约占75%[1]。 针灸是治疗脑血管疾病的有效手段,可体现中药的优势和特色,其疗效得到临床认可,研究发现,针刺神庭、百会两穴后可改善缺血再灌注损伤大鼠神经功能、改善记忆和学习能力[2-3]。 突触可塑性指大脑神经元损伤后,突触功能和形态上的改变,是脑神经元可塑性的基础[4]。 在正常生理条件下,小胶质细胞M1、M2 亚型极化维持动态平衡,以维护神经系统正常功能,但受外界刺激后,小胶质细胞偏向 M1 型极化,从而促进 TNF-α、IL-1β 表达,加重中枢神经损伤[5]。 随着miRNA 的研究,研究发现电针能够激活miR-21 的表达并影响脑缺血损伤[6],电针调控miR-21 可能是其机制之一。 转录激活因子 3 (signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)信号通路是脑缺血引起损伤的重要途径,在脑缺血模型大鼠脑组织中被激活,抑制STAT3 活性可缓解大鼠脑损伤症状[7],且电针能影响STAT3 的表达。 因此本研究构建局灶性脑缺血大鼠模型,观察电针对大鼠突触可塑性、小胶质细胞极化的影响,并探讨影响机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF 级雄性Wistar 128 只大鼠均购自广州中医药大学实验动物中心[SCXK(粤)2018-0034],在广州中医药大学实验[SYXK(粤)2018-0001],均7 周龄,体重220 ~250 g,于广州中医药大学实验室饲养,自由饮食饮水,光照周期为12 h,本研究经三亚市中医院伦理委员会批准(SYLL-2017-12),并按实验动物使用的3R 原则给予人道的关怀。

1.2 主要试剂与仪器

miR-21 和内参U6 引物(苏州泓迅生物科技股份有限公司);尼莫地平片(天津市中央药业有限公司,规格:每片20 mg,国药准字 119004);兔抗鼠STAT3、兔抗鼠 p-STAT3、兔抗鼠 JAK2、兔抗鼠 p-JAK2、兔抗鼠内参 β-Actin、羊抗兔 IgG-HRP 二抗(上海恒斐生物科技有限公司, 货号分别为K002382P、 bs-3429R-1、 K001746P、 K006248P、K006153P、SE134);Dylight 405 标记山羊抗兔 IgG(H+L)(北京百奥莱博科技有限公司,货号为YT868);G-6805 型电针仪(上海华谊医用仪器有限公司);无菌针灸针(0.3 mm×25 mm)(苏州华佗苏州华佗医疗器械有限公司);HM525 型冷冻切片机(德国MICROM 公司);ZF-388 型全自动凝胶成像分析系统(深圳三利化学品有限公司);BSF-30 型荧光显微镜(上海巴拓仪器有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型构建

采用大脑中动脉阻塞法(middle cerebral artery occlusion,MCAO)构建大脑中动脉致局灶性脑缺血模型[8],大鼠用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,右侧卧位固定,用消毒后的手术剪沿大鼠耳眼连线中点剪开皮肤,分离右侧颈动脉、迷走神经、颈外动脉和颈内动脉,颈外动脉远端用细线双重结扎离断,并在舌和上颌动脉分支近端切断,小切口缝合线插入颈外动脉和颈内动脉残端。 通过激光多普勒血流计监控脑血流,当出现至少70%脑血流减少时纳入研究对象,闭塞60 min 建立局灶性脑缺血模型,假手术组只暴露大脑中动脉,不行凝闭。 分别模型建立后和治疗3 周结束后参照Longa 评分[9]标准评价大鼠情况:手提大鼠尾巴悬空,无神经功能损伤,两前肢向地面伸直(0 分);轻微神经功能缺损,病灶对侧前肢肘曲,抬高,肘关节伸直,肩内敛(1 分);中度局灶性神经功能缺损,伴有瘫痪侧转现象(2 分);重度局灶性神经功能缺损,伴有向病灶对侧跌倒现象(3 分);无自发活动和认知水平下降(4 分)。 剔除无症状(0 分)或症状过重(4 分)大鼠,1~3 分说明模型构建成功。 0 分说明假手术组大鼠构建成功。

1.3.2 分组及治疗方法

模型制备成功大鼠分为模型组、电针组、尼莫地平组,每组32 只,假手术组32 只。 模型建立后2 h 电针组选取神庭、百会两穴,用0.3 mm×25 mm 的1 寸毫针直刺神庭穴0.5 寸,斜刺百会穴0.5 寸,以5~10 次/s,强度 3~5 V 的疏密波,时间 30 min 行电针治疗,每天一次;尼莫地平组每天灌胃给药一次(20 mg/kg,2 mL)[10];假手术组、模型组灌胃给药等体积的生理盐水,连续治疗3 周。

1.3.3 TTC 染色大鼠脑组织检测大鼠梗死情况

治疗3 周结束后,各组随机选取8 只大鼠用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,手术开胸,暴露心脏,用37℃生理盐水灌注心脏,手术取经上述操作大鼠脑组织,置于-20℃冰箱中冷冻0.5 h 后取出,切片(2 mm),避光条件下置于37 ℃ 2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)中染色0.5 h。 可见染色后脑未梗死区域呈红色,梗死区域呈白色,用Image Pro Plus 软件计算每个脑组织的梗死体积。

1.3.4 透射电镜观察脑皮层区突触超微并对形态学计量

治疗结束后,各组随机选取8 只大鼠用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠,立刻手术开胸,暴露心脏,行左心室主动脉插管,灌入100 mL 37℃生理盐水,随后用PBS(含有2.5%戊二醛和4%多聚甲醛)灌流0.5 h。 手术取经上述操作大鼠左侧缺血脑皮层(见图1),部分脑皮层放入PBS(含有2%戊二醛和2%多聚甲醛)溶液中固定3 h,固定结束后用PBS 清洗3 次,4℃条件下用1%锇酸固定1 h,PBS 清洗3 次,梯度乙醇洗脱,丙酮脱水,在含有丙酮的包埋液中渗透2 h,纯Epon812 包埋液中渗透3 h,渗透结束后置于60℃烘箱中过夜,超薄切片(约60 nm),将切片至于铜网上(300 目),经柠檬酸铅和醋酸铀染色,电镜观察突触超微结构并根据Bertoni-Freddari 等[11]方格点计数法定量分析面数密度(Nv)、突触体密度(Vv)、突触连接带面密度(Sv)、突触后致密物质(PSD),用生物图像分析仪定量分析突触间隙宽度和突触界面曲面率。

图1 大鼠脑皮层Figure 1 Cerebral cortex of rats

1.3.5 免疫荧光检测脑皮层区小胶质细胞极化情况

部分脑皮层随后将切片平铺至多聚赖氨酸处理后的载玻片上,PBS 清洗3 次,60℃烘箱烤片0.5 h,PBS 清洗3 次,室温下在3 %过氧化氢溶液中孵育10 min,转移至5%胎牛血清的湿盒中孵育0.5 h,孵育结束后加入兔抗鼠 Iba1、iNOS、Arg1 一抗(1 ∶200),4℃湿盒内孵育过夜,滴加Dylight 405 标记山羊抗兔 IgG(H+L)(1 ∶200),37℃ 孵育 2 h,使用DAPI 染核,封片,荧光显微镜拍照,使用Image J 软件计数阳性细胞数。

1.3.6 qRT-PCR 法检测脑皮层区miR-21 水平

治疗结束后,剩余8 只大鼠脱颈处死,立刻手术取出脑皮层,取部分TRIzol 法提总RNA,按照逆转录试剂盒说明书操作行反转录为cDNA。 用qRTPCR 仪测定 miR-21 水平,miR-21 上游引物:5’-GAAATGCCTCACAGCTATCGT-3’;下游引物:5’-CCTCCACAAAGAGCCACC-3’。 内参 U6 上游引物5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’; 下 游 引物:5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。 反应体系(20 μL):上下游引物各 0.5 μL,2×Mix 10 μL,cDNA 模板 1 μL,H2O 8 μL。 反应条件设定为:95℃预变性5 min,95℃ 10 s、62℃ 30 s,78℃ 30 s,45个循环,72℃延伸 5 min。 2-ΔΔCT法对各组 miR-21 水平定量分析。

1.3.7 蛋白印迹法测定脑皮层区JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白水平

部分脑皮层区置于含200 μL 蛋白裂解液的研钵中,充分研磨,离心取上清液,根据BCA 试剂盒说明书测定总蛋白含量,上样行SDS-PAGE 电泳(浓缩胶 80 V、30 min,分离胶 120 V、60 min 电泳),湿法转膜,室温下5% BSA 封闭位点1 h,分别加入兔抗鼠JAK2、兔抗鼠 p-JAK2、兔抗鼠 STAT3、兔抗鼠p-STAT3、兔抗鼠内参 β-Actin 抗体(1 ∶1000),4 ℃孵育过夜,加入羊抗兔IgG-HRP 二抗(1 ∶1000),37℃条件下孵育1 h 后,ECL 显影、曝光、凝胶成像仪拍照观察并根据灰度值分析蛋白水平。

1.4 统计学方法

使用SPSS 22.0 版软件对数据进行统计分析。数据以平均数±标准差()形式表示,多组比较行单因素方差分析,任意两组相比行SNK-q检验。P<0.05 说明差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠治疗后神经功能缺损评分

与假手术组相比,模型组大鼠神经功能缺损评分显著升高(P<0.05);与模型组相比,电针组和尼莫地平组大鼠神经功能缺损评分明显降低(P<0.05);电针组与尼莫地平组大鼠神经功能缺损评分差异无统计学意义(P>0.05)。 见表1。

表1 各组大鼠治疗后神经功能缺损评分(, n=32)Table 1 Score of nerve function defect after treatment in each group

表1 各组大鼠治疗后神经功能缺损评分(, n=32)Table 1 Score of nerve function defect after treatment in each group

注:与假手术组相比,aP<0.05;与模型组相比,bP<0.05。Note. Compared with the sham group,aP < 0.05. Compared with the model group,bP < 0.05.

组别Groups神经功能缺损评分Neurological deficit score假手术组Sham operation group 0.00±0.00模型组Model group 2.35±0.13a电针组Electroacupuncture group 1.72±0.10ab尼莫地平组Nimodipine group 1.73±0.11ab

2.2 各组大鼠脑梗死体积比较

与假手术组相比,模型组大鼠脑梗死体积显著升高(P<0.05);与模型组相比,电针组和尼莫地平组大鼠脑梗死体积明显降低(P<0.05);电针组与尼莫地平组大鼠脑梗死体积差异无统计学意义(P>0.05)。 见图 2 和表 2。

表2 各组大鼠脑梗死体积比较( ,n=8)Table 2 Comparison of cerebral infarction volume of rats in each group

表2 各组大鼠脑梗死体积比较( ,n=8)Table 2 Comparison of cerebral infarction volume of rats in each group

注:与假手术组相比,aP<0.05;与模型组相比,bP<0.05。Note. Compared with the sham group,aP < 0.05. Compared with the model group,bP < 0.05.

组别Groups脑梗死体积(mm3)Cerebral infarction volume假手术组Sham operation group 0.00±0.00模型组Model group 65.19±6.83a电针组Electroacupuncture group 20.15±3.17ab尼莫地平组Nimodipine group 19.74±3.91ab

图2 各组大鼠脑梗死情况Note. A, Sham operation group. B, Model group. C,Electroacupuncture group. D, Nimodipine group.Figure 2 Cerebral infarction of rats in each group

2.3 各组大鼠脑皮层区突触超微结构观察和形态学计量分析

模型组突触数目明显减少,神经突起中细胞骨架结构散乱,突触间隙变窄,连接带变短,伴有巨大空泡样,轴浆涨大;电针组可见突触数量增多,神经突起中细胞骨架结构清晰,突触间隙变宽,连接带变长,伴有少量空泡样;尼莫地平组突触超微结构与电针组类似,见图3。 与假手术组相比,模型组大鼠突触 Nv、Vv、Sv、PSD、突触界面曲面率、突触间隙宽度明显降低(P<0.05);与模型组相比,电针组、尼莫地平组大鼠突触 Nv、Vv、Sv、PSD、突触界面曲面率、突触间隙宽度显著升高(P<0.05);电针组与尼莫地平组大鼠突触 Nv、Vv、Sv、PSD、突触界面曲面率、突触间隙宽度差异无统计学意义(P>0.05),见图 3 和表3。

表3 各组大鼠突触形态学计量分析( ,n=8)Table 3 Morphological and quantitative analysis of synapses in rats of each group

表3 各组大鼠突触形态学计量分析( ,n=8)Table 3 Morphological and quantitative analysis of synapses in rats of each group

注:与假手术组相比,aP<0.05;与模型组相比,bP<0.05。Note. Compared with the sham group,aP < 0.05. Compared with the model group,bP < 0.05.

组别Groups面数密度Nv(piece/μm3)突触体密度Vv(μm2/μm3)突触连接带面密度Sv(μm2/μm3)突触后致密物质PSD(nm)突触界面曲面率Surface rate of synaptic interface突触间隙宽度(nm)Width of synaptic space假手术组Sham operation group 2.15±0.18 0.12±0.03 0.14±0.02 49.57±3.06 1.25±0.06 25.78±1.29模型组Model group 0.48±0.06a 0.04±0.01a 0.04±0.02a 32.18±2.29a 1.06±0.04a 13.57±1.18a电针组Electroacupuncture group 1.29±0.14ab 0.08±0.02ab 0.07±0.03ab 39.01±3.18ab 1.12±0.03ab 18.70±1.24ab尼莫地平组Nimodipine group 1.26±0.15ab 0.08±0.03ab 0.07±0.02ab 40.02±3.37ab 1.13±0.05ab 17.69±1.36ab

图3 各组大鼠脑皮层区突触超微结构Note. A, Sham operation group. B, Model group. C,Electroacupuncture group. D, Nimodipine group.Figure 3 Synaptic ultrastructure of cerebral cortex of rats in each group

2.4 各组大鼠脑皮层区小胶质细胞极化情况比较

与假手术组相比,模型组大鼠脑皮层M1 小胶质细胞(iNOS)数量显著升高(P<0.05),M2 型小胶质细胞(Arg1)数量明显降低(P<0.05);与模型组相比,电针组和尼莫地平组M1 型小胶质细胞数量明显降低(P<0.05),M2 型小胶质细胞数量显著升高(P<0.05);电针组与尼莫地平组M1 型小胶质细胞和M2 型小胶质细胞数量差异无统计学意义(P>0.05),见图 4 和表 4。

图4 各组大鼠脑皮层区小胶质细胞数Note. A, Sham operation group. B, Model group. C, Electroacupuncture group. D, Nimodipine group.Arrows indicate positive cells.Figure 4 Number of microglias in the cortex of rats in each group

表4 各组大鼠小胶质细胞数( ,n=8)Table 4 Number of microglias in each rat group

表4 各组大鼠小胶质细胞数( ,n=8)Table 4 Number of microglias in each rat group

注:与假手术组相比,aP<0.05;与模型组相比,bP<0.05。Note. Compared with the sham operation group,aP < 0.05. Compared with the model group,bP < 0.05.

组别Groups M1 型小胶质细胞(个/视野)M1 type small keratinocytes(piece/field of vision)M2 型小胶质细胞(个/视野)M2 type small keratinocytes(piece/field of vision)假手术组 Sham operation group 52.74±7.28 150.46±15.73 12.06±2.71a电针组 Electroacupuncture group 22.29±5.14ab 50.84±6.22ab尼莫地平组Nimodipine group 18.25±7.10ab 51.49±7.53ab模型组Model group 98.48±10.76a

2.5 各组大鼠脑皮层区 miR-21、 STAT3、 p-STAT3、JAK2、p-JAK2 水平

各组大鼠脑皮层区STAT3、JAK2 水平无明显变化(P>0.05)。 与假手术组相比,模型组大鼠脑皮层区 miR-21、p-STAT3、p-JAK2 水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,电针组和尼莫地平组大鼠脑皮层区 miR-21、p-STAT3、p-JAK2 水平明显降低(P<0.05);电针组与尼莫地平组大鼠脑皮层区miR-21、p-STAT3、p-JAK2 水平差异无统计学意义(P>0.05)。 见图 5 和表 5。

图5 各组大鼠脑皮层区 STAT3、p-STAT3、JAK2、p-JAK2 水平Note. A, Sham operation group. B, Model group. C,Electroacupuncture group. D, Nimodipine group.Figure 5 STAT3, p-STAT3, JAK2 and p-Jak2 levels in the cerebral cortex of rats in each group

表5 各组大鼠脑皮层区miR-21、STAT3、p-STAT3、JAK2、p-JAK2 水平( ,n=8)Table 5 miR-21, STAT3, p-STAT3, JAK2, and p-JAK2 levels in the cerebral cortex of rats in each group

表5 各组大鼠脑皮层区miR-21、STAT3、p-STAT3、JAK2、p-JAK2 水平( ,n=8)Table 5 miR-21, STAT3, p-STAT3, JAK2, and p-JAK2 levels in the cerebral cortex of rats in each group

注:与假手术组相比,aP<0.05;与模型组相比,bP<0.05。Note. Compared with the sham group,aP < 0.05. Compared with the model group,bP < 0.05.

组别Groups miR-21/U6 p-STAT3/STAT3 p-JAK2/JAK2假手术组 Sham operation group 1.06±0.17 0.24±0.04 0.27±0.04模型组 Model group 2.46±0.25a 1.25±0.18a 1.30±0.14a电针组 Electroacupuncture group 1.71±0.19ab 0.81±0.09ab 0.76±0.09ab尼莫地平组 Nimodipine group 1.72±0.21ab 0.77±0.08ab 0.77±0.08ab

3 讨论

脑缺血中医论证与虚(气虚、阴虚)、风(外风、肝风)、气(气逆)、火(心火、肝火)、血(血瘀)、痰(湿痰、风痰)六端相关[12]。 针灸作为脑缺血的治疗手段,神庭位于人中心之处,神庭“神处其中则灵,灵则应,应则保身”,可调控人神经系统[13]。 百会为百脉之宗,各经脉之气汇聚之地,可贯达全身,连贯全身周穴,调控机体阴阳平衡[14]。 本研究为选择神庭、百会穴行电针治疗,探究电针对局灶性脑缺血大鼠的影响,MCAO 法构建大脑中动脉致局灶性脑缺血模型,与假手术组相比,模型组大鼠神经功能缺损评分、脑梗死体积显著升高,提示模型构建后神经功能损伤严重。 与模型组相比,经电针后,大鼠神经功能缺损评分、脑梗死体积明显降低,说明电针能够缓解局灶性脑缺血大鼠脑损伤,具有一定临床应用价值。

大脑皮层神经网络作为自组织、信息处理、行为适应的复杂系统由大量的神经元组成,正常情况下神经元的兴奋性和抑制性突触可塑性处于平衡状态,维持大脑信息生成和传递效率,但在脑缺血后出现兴奋性氨基酸毒性作用,导致突触可塑性发生改变[15-16]。 本研究发现,与假手术组相比,模型组大鼠脑组织突触数目明显减少、间隙变窄、连接带变短,神经突起中细胞骨架结构散乱,伴有巨大空泡样,轴浆涨大,Nv、Vv、Sv、PSD、突触界面曲面率、突触间隙宽度明显降低,说明模型组大鼠突触形态和结构改变。 经电针治疗后,大鼠脑组织突触数量增多、间隙变宽、连接带变长,神经突起中细胞骨架结构清晰,突触 Nv、Vv、Sv、PSD、突触界面曲面率、突触间隙宽度显著升高,说明电针治疗可保护突触可塑性,恢复突触界面曲面率,可能对于自组织、信息处理、行为适应有缓解作用。 小胶质细胞对于促进突触发育、维持突触正常功能和突触可塑性具有调节作用,脑缺血后会导致小胶质极化,小胶质与神经元接触时间延长,导致部分突触结构消失,缺血早期梗死区向M2 型极化;随着病情的严重向M1 型极化,而M1 型主导炎症反应,从而过表达CD86、MHCⅡ、iNOS、Fcγ 受体,可分泌炎性介质以加重中枢神经细胞炎症反应,导致脑组织受损[17]。本研究发现,与假手术组相比,模型组大鼠海马区M1 型小胶质细胞数量显著升高,M2 型小胶质细胞数量明显降低,提示该研究中脑缺血已处于严重时期,小胶质细胞向M1 型极化严重,而M1 型主导炎症反应,加重脑损伤。 经治疗后小胶质细胞可向M2亚型极化,从而过表达CD206、Arg1 以分泌保护因子清除参与中枢神经免疫、修复,同时可清除中枢代谢废物,实现对神经的保护[18]。 本研究同样证明,经电针治疗后,大鼠M1 型小胶质细胞数量明显降低,M2 型小胶质细胞数量显著升高,说明电针可改善小胶质细胞极化失衡,恢复神经功能。 但是电针通过何种信号通路以保护突触可塑性和维维持胶质细胞极化平衡有待进一步研究。

本研究发现,与假手术组相比,miR-21 水平和STAT3、JAK2 磷酸化水平显著升高,说明脑缺血大鼠脑皮层区miR-21/JAK2/STAT3 通路被激活。 在脑缺血大鼠脑皮层区N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)高度活化可诱导JAK2 磷酸化,从而促使STAT3 磷酸化参与调节破坏突触可塑性[19]。 miR-21 可能调控多基因、多环路表达紊乱,可影响一系列调控失常的精神分裂结构网络,STAT3 可参与神经细胞炎症反应,以加重中枢神经损伤;miR-21 其中通过别的通路调控STAT3 信号通路在精神分裂症大鼠脑组织中处于激活状态影响疾病[20]。 经电针治疗后,大鼠脑皮层区 miR-21 水平和 STAT3、JAK2 磷酸化水平明显降低,说明电针可抑制miR-21/JAK2/STAT3 通路活性。

综上所述,局灶性脑缺血大鼠行神庭、百会穴电针治疗可保护突触可塑性和维持胶质细胞极化平衡,可能与抑制miR-21/JAK2/STAT3 通路活性相关。 但是具体调控机制还有待深入研究。