胡艳芬张文桃朱剑军吴 昊刘 铭

(山西医科大学基础医学院医学细胞生物与遗传学教研室,太原 030001)

肝癌的发病率位居全球恶性肿瘤第六位,死亡率位居第三位, 其中肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)占肝癌的 75%~85%[1]。 每年全球新增肝癌病例约84 万,新增死亡病例约78 万[1]。与HCC 发生相关的主要危险因素包括:乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV) 和丙型肝炎病毒(Hepatitis V virus, HCV)慢性感染、黄曲霉毒素、酒精过量摄入、肥胖、吸烟和2 型糖尿病。 由于多数患者在首诊时已处于进展期,导致肝癌患者预后总体较差[1-3]。 已鉴定发现 p53、TERT 启动子突变、Akt/mTOR、Wnt/β-catenin、血管内皮生长因子受体、内皮生长因子受体/Ras/MAPK 等与肝细胞癌发生发展密切相关[4-6]。 但是,截至目前为止,肝细胞癌的发病机制仍不完全清楚[1-2]。 因此,继续寻找与肝细胞癌发生发展有关的分子靶标具有重要的临床意义。 组胺受体H3(histamine receptor H3,HRH3)是组胺的一种受体[7]。 组胺通过与其受体(HRH1,HRH2,HRH3,HRH4)结合发挥作用[8]。 人HRH3基因定位于第20 号染色体(20q13.33),GenBank 登录号为NM_007232,编码的蛋白由446 个氨基酸组成。 HRH3 是细胞膜整合蛋白,归属于G 蛋白偶联受体家族,在调控神经递质释放方面发挥重要作用[7]。 研究表明,在平滑肌细胞中,HRH3 能够增强电压依赖性的钙离子电流[9]。 国内外已有文献报道HRH3 在多种恶性肿瘤中发挥重要作用,包括,胆管癌、胰腺癌、前列腺癌等[7-8,10-13]。 但是,截至目前为止,HRH3 在肝细胞癌的研究较少。 因此,本文基于 ULACAN、STRING、Kaplan-Meier Plotter 等公共数据库,全面分析HRH3 在肝细胞癌组织中的表达水平和功能作用,初步探讨HRH3 作为一种新的HCC患者早期筛查及预后判断的肿瘤标志物的价值,为后续开展实验性研究及肝细胞癌早期诊断和预后判断提供理论指导。

1 材料和方法

1.1 数据库来源和方法

利用ULACAN 数据库(http:/ /ualcan.path.uab.edu/index.html)分析HRH3 在 HCC 中的表达水平[14]。 登录 ULACAN 数据库首页,设定条件:1)TCGA Analysis;2)Scan by Gene(s):HRH3;3)TCGA Dataset: Liver hepatocellular carcinoma; 4) 点击Explore;5)点击Expression;6)HRH3 expression based on, 选择 Sample types。 7) 点击HRH3 expression based on 后方的二级菜单,分析HRH3 表达水平与HCC 患者临床病理因素的关系。 以P<0.05 为差异有统计学意义。

1.2 PPI 蛋白互作网络和基因功能分析

基于 STRING 数据库(https:/ /string-db.org/cgi/input.pl?taskId)分析HRH3 的蛋白互作网络和基因功能分析。 登录STRING 数据库首页,设定条件:1) Protein name; HRH3; 2) Organism: Homo sapiens;3)点击Search;4)点击系统默认选项;5)点击Continue;6)完成蛋白互作网络;7)点击Analysis;8)查看 Functional enrichment in your network, 下载Biological process (GO) 数 据;9) 下 载 Molecular Function(GO) 数据;10) 下载 Cellular Component(GO)数据;11)下载KEGG Pathways 数据;12)点击Viewers,选择Coexpression,点击 Tables,下载 HRH3与其互作蛋白共表达数据。

1.3 生存预后分析

基于Kalpa-Meier Plotter 数据库(http:/ /kmplot.com/analysis/)分析HRH3 与HCC 患者临床生存预后的关系。 登录 Kaplan-Meier Plotter 数据库首页,选择mRNA RNA-Seq,选择Start KM Plotter for liver cancer, 设定条件:1)Gene symbol:HRH3;2)Split patients by:选择 Auto select best cutoff;3)Survival:总生存期选择OS;无复发生存期选择RFS;4)其它选择系统默认条件;5)分析HRH3 生存预后与HCC 患者临床病理因素的关系。 按照中位数法将肝癌样本分为高表达组和低表达组。 以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HRH3 在肝癌组织中的表达水平

采用TCGA 数据库,分析HRH3 在371 例肝癌组织中的表达水平。 结果发现,HRH3 在肝癌组织中的表达水平显著高于其在正常肝组织中的表达水平(P<0.01)(图1)。 进一步研究分析,HRH3 在肝癌组织中的表达水平与患者性别无关(P=0.711)(图 2A)。HRH3 在 41~60 岁年龄段患者肝癌组织中的表达水平显著低于其在61~80 岁年龄段患者中的表达水平 (P=0.045)(图2B)。 同时,我们的研究结果显示,HRH3 在肝癌组织中的表达水平与肿瘤分期、分化程度、淋巴结转移、TP53 基因突变等因素无关(均P>0.05)(图2C~2F)。

图1 HRH3 基因在肝癌组织中的表达水平Figure 1 Gene expression of HRH3 in HCC

图2 HRH3 表达水平与肝癌患者临床病理特征的关系Note. A, Gender. B, Age. C, Tumor stage. D, Tumor differentiation. E, Nodal metastasis. F, TP53 mutation. D, 1, Well differentiated. 2, Moderately differentiated. 3, Poorly differentiated. 4,Undifferentiated. E, N0, No regional nodal metastasis. N1, Metastases in 1 to 3 axillary lymph node.Figure 2 Relationship between the HRH3 expression and the clinicopathologic characteristics of HCC patients

2.2 生存分析结果

Kaplan-Meier Plotter 数据库中HRH3 在肝细胞癌中的研究样本为364 例。 结果显示,和HRH3 高表达组相比,HRH3 低表达组的总生存期(overall survival, OS) 和无复发生存期(recurrence-free survival, RFS)均显著缩短(HRH3 低表达组的OS为33.5 月,HRH3 高表达组的 OS 为 82.9 月,P<0.05;HRH3 低表达组的 RFS 为 18.3 月,HRH3 高表达组的RFS 为48.43 月,P<0.01)(图3)。

图3 HRH3 在肝癌中的生存分析Figure 3 Survival analysis of HRH3 gene in HCC

此外,低表达HRH3 组早期患者(Ⅰ期和Ⅱ期)的OS 显著低于高表达HRH3 早期患者。 但是,低表达HRH3 晚期患者(Ⅲ期和Ⅳ期)的OS 显著高于高表达HRH3 晚期患者。HRH3 表达水平与无血管侵袭患者的生存预后相关(P<0.01),而HRH3 表达水平与已经发生血管侵袭患者的生存预后差异无统计学意义(P=0.28)。HRH3 表达水平与男性患者的生存预后相关(P<0.01),而HRH3 表达水平与女性患者的生存预后差异无统计学意义(P=0.21)。

2.3 HRH3 基因 GO 分析和 KEGG 通路分析

HRH3 基因功能富集分析结果显示,细胞组成方面主要与细胞膜、神经元、质膜的整体构件、突触及突触前结构等相关;分子功能方面主要与G 蛋白偶联的受体活性、神经递质受体活性、胺受体活性、和G 蛋白偶联的5-羟色胺受体活性等相关;生物过程主要与G 蛋白偶联受体信号途径、抑制型腺苷酸环化酶信号途径、5-羟色胺受体信号途径、和谷氨酸受体途径等相关(图4)。 信号通路富集结果显示,HRH3 基因主要与5-羟色胺突触传递、谷氨酸能突触信号通路、味觉传递、酒精代谢等信号通路显著相关(图5)。

图4 HRH3 基因的 GO 分析Figure 4 GO analysis of HRH3 gene

图5 HRH3 基因的KEGG 通路分析Figure 5 KEGG pathway analysis of HRH3 gene

2.4 基于STRING 构建HRH3 蛋白互作网络

通过STRING 数据库,构建蛋白质-蛋白质相互作用网络。 结果如图6 所示,HRH3 蛋白与5-羟色胺 1A 受 体 ( 5-hydroxytryptamine receptor 1A,HTR1A)、5-羟色胺 1E 受体(5-hydroxytryptamine receptor 1E, HTR1E)、 5-羟 色 胺 5A 受 体 (5-hydroxytryptamine receptor.5A,HTR5A)、代谢型谷氨酸受体3(metabotropic glutamate receptor 3,GRM3)、代谢型谷氨酸受体4(metabotropic glutamate receptor 4,GRM4)、代谢型谷氨酸受体 8 (metabotropic glutamate receptor 8,GRM8)、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白亚基γ-3(guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(O) subunit gamma-3,GNG3)、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白亚基 γ-13(guanine nucleotide-binding protein G (I)/G (S)/G (O) subunit gamma-13,GNG13)、脑啡肽原(proenkephalin-B,PDYN)、黑色素富集激素受体2(melanin-concentrating hormone receptor 2,MCHR2)有相互作用。

图6 HRH3 基因的蛋白互作网络图Figure 6 Protein interaction network diagram of HRH3 gene

2.5 基于STRING 分析HRH3 与其互作蛋白共表达相关性

通过STRING 数据库,分析HRH3 与其互作蛋白的表达相关性。 结果如图7 所示,HRH3 蛋白与5-羟色胺受体家族成员有较好的相关性。 HRH3 表达水平与HTR5A 表达水平呈正相关,相关系数是0.476;HRH3 表达水平与HTR1A 表达水平呈正相关,相关系数是0.362;HRH3 表达水平与HTR1E 表达水平呈正相关,相关系数是0.335。

图7 HRH3 与相关分子的共表达分析Figure 7 Co-expression analyses for HRH3 and its interacted proteins

3 讨论

原发性肝癌发病率位居全球所有恶性肿瘤第6位,死亡率高居第2 位,严重威胁人民的生命和健康[1-2]。 原发性肝癌主要包括肝细胞癌、肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)和混合型肝癌(HCC-ICC)3 种不同病理学类型,其中 HCC 占75%~85%[1]。 近年来,研究报道HRH3 在多种恶性肿瘤中表达水平异常,包括HCC,胆管癌,黑色素瘤、胰腺癌,乳腺癌等[8,10,13]。 Yu 等[8]报道HRH3在HCC 中呈显著高表达。 Zhang 等[15]研究结果也表明HRH3 在HCC 中显著高表达,提示HRH3 可能与 HCC 发生发展有关。 Francis 等[11]报道HRH3 在胆管癌组织和细胞中呈显著高表达。 Chen 等[10]在前列腺癌中也发现HRH3 呈显著高表达。 与上述研究结果相似,本研究利用TCGA 公共数据库分析HRH3 在肝癌中的表达情况,发现与正常肝组织相比,HRH3 在肝细胞癌中表达水平显著升高。 以上研究均表明,HRH3 在肝癌组织中呈高表达,其可能与肝癌的发生发展有关。

此外,本研究还发现,肝细胞癌患者中HRH3 表达水平与肿瘤分期、分化程度、淋巴结转移、TP53 基因突变等因素无关。 Zhang 等[15]报道,HRH3 在低分化肝细胞癌组织中的表达水平显著高于其在高-中分化肝细胞癌组织中的表达水平,提示HRH3 与肝细胞癌的分化有关。 Chen 等[10]报道,HRH3 表达水平与前列腺癌的Gleason 评分相关。 我们推测上述研究结果的不一致,可能与肿瘤类型和入组标准不同有关。 本研究系统分析了HRH3 在371 例肝细胞癌患者中的表达水平与其临床病理因素的关系,入组患者较以往研究多,结果相对可靠。

基因功能富集分析结果发现,在细胞组成方面,HRH3 及其相互作用蛋白主要分布于细胞膜、神经元、和突触等;分子功能方面主要与G 蛋白偶联受体的活性有关,包括5-羟色胺受体活性等;生物过程主要与G 蛋白偶联受体介导的信号转导有关,包括:抑制型腺苷酸环化酶信号途径、5-羟色胺受体信号途径、谷氨酸受体途径等相关。 KEGG 信号通路富集结果显示,HRH3 基因主要与5-羟色胺信号传递、谷氨酸信号通路、酒精代谢等信号通路相关。环磷酸腺苷(cyclic AMP, cAMP)是细胞内重要的信使分子[16]。 腺苷酸环化酶(adenylate cyclase,AC)在G 蛋白激活后,催化ATP 脱去焦磷酸形成cAMP[16]。 与我们的分析结果一致,Zhang 等[15]研究结果发现,在HepG2 细胞敲除HRH3 后,细胞内cAMP 水平升高;在PLC/PRF/5 细胞过表达HRH3后,细胞内cAMP 水平降低,提示HRH3 参与调控肝癌细胞 cAMP 生成。 然而,HRH3 是否参与5-羟色胺受体信号途径、谷氨酸受体介导的信号转导、和酒精代谢,这有待实验进一步证实。

基于STRING 数据库,本研究发现,HRH3 蛋白与5-羟色胺受体、代谢型谷氨酸受体等有紧密相互作用。 相关性研究发现,HRH3 与5-羟色胺受体家族成员有较好的相关性。 5-羟色胺受体有十三种亚型,大多数归属于G 蛋白偶联受体家族[17]。 研究报道,5-羟色胺受体表达异常,导致5-HT 代谢和转运异常与多种消化道恶性肿瘤的发生进展紧密相关,包括结直肠癌、肝癌、胆管癌、胰腺癌等[17-19]。Abdel-Razik 等[18]报道5-羟色胺是一种可能与HCC发生相关的生物胺。 5-羟色胺可与PIVKA-II 联合用于慢性丙型肝炎-肝硬化患者早期HCC 的筛选,具有很好的临床应用前景。 本研究发现5-HTR1A,5-HRT1E 和5-HTR5A 与 HRH3 有紧密相互作用。5-HTR1A,5-HRT1E 和 5-HTR5A 均归属于 G 蛋白偶联受体家族,为Gi/o 蛋白,与腺苷酸环化酶偶联,可下调细胞内cAMP 浓度[20]。 以上研究提示,HRH3可能与5-羟色胺受体存在相互作用,其通过调控胞内cAMP 生成,在肝细胞癌的发生发展过程中发挥重要作用。

以往有研究报道HRH3 在恶性肿瘤的发生和发展过程中发挥双重作用。 例如,Tanaka 等[21]研究报道雄性 ICR 小鼠喂食含有 HRH3 抑制剂Clobenpropit 的食物能够显著降低结肠腺癌的发病率,提示HRH3 发挥促进结肠癌发生的作用。 Lin等报道,抑制HRH3 能显著抑制恶性胶质瘤细胞肿瘤生长、侵袭和上皮间质转化,提示HRH3 在恶性胶质瘤的发展过程中发挥促癌作用[13]。 然而,Francis 等[11]通过体内外实验均证实HRH3 发挥抑制胆管癌细胞生长作用,提示HRH3 发挥抑癌作用。 Davenas 等[22]研究结果表明,抑制 HRH3 活性后,鼠肝癌细胞McA-RH7777 的细胞增殖活性显著降升高,提示HRH3 发挥抑癌作用。 我们的研究结果表明,在早期HCC 患者群体中,低表达HRH3 组的总生存期显著低于高表达HRH3 组;而在晚期HCC 患者群体中,低表达HRH3 组的总生存期显著高于高表达HRH3 组,提示HRH3 在肝细胞癌早期的发生过程中可能充当抑癌基因的角色,抑制肝癌发生,而在肝细胞癌晚期的发展过程中可能充当癌基因的角色,促进肝癌进展。 这一结果有待在更多的临床标本组织和公共数据集进一步证实。

综上,本研究发现HRH3 在HCC 中呈高表达,其可能与5-羟色胺受体相互作用,调控胞内cAMP生成,促进肝细胞癌的恶性进展。 此外,HRH3 高表达与早期 HCC 患者的良好预后相关,而与晚期HCC 患者的不良预后相关。 基于此,我们猜测HRH3 在HCC 早期发生过程中发挥抑癌作用,而在HCC 晚期发展过程中充当促癌作用。 因此,HRH3可能是HCC 诊断、治疗和预后评估的一个潜在肿瘤标志物。