雷佳，倪雪晨，程伟，刘伟林，尤恒，丁坤明，王行国

(1.湖北大学生命科学学院, 湖北 武汉 430062; 2.咸宁市芽旗香茶叶研究中心,咸宁市农业科学院, 湖北 咸宁 437100)

0 引言

1 材料与方法

1.1 细菌菌株与培养茶树草螺菌(Herbaspirillumcamelliae) WT00C 由本实验室分离并保存. 细菌日常在含有5 μg /mL 壮观霉素和 10 μg /mL 氨苄青霉素的营养肉汤(NB) 培养基(蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、加水至1 L,pH 7.2) 中34 ℃培养,-80 ℃贮存. 放大培养时,先用NB 培养基活化,再用LB 培养基(胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、酵母提取物5 g、加水至1 L, pH 7.2) 37 ℃培养[1,4]．

1.2 茶树内生草螺菌小规模发酵在上海保兴生物设备有限公司5 L发酵罐(Biotech)中加入3 L LB液体培养(1%蛋白胨,0.5%酵母提取物,1%氯化钠),121 ℃灭菌30 min. 待LB培养基冷却后,按照1%的接种量接入30 mL 活化过夜的茶树内生草螺菌WT00C种子液.依据早前研究的优化培养条件[1,4], 制定发酵条件,即温度为34 ℃、转速200 r/min、pH控制为7.0、通气量为1 vvm. 每隔一段时间进行一次取样并测定菌液OD600,待发酵菌液OD600值趋于平稳后停止发酵.

1.3 茶树内生草螺菌规模化发酵首先制备发酵种子液.使用小型发酵罐(5 L), 加入3 L LB液体培养(1%蛋白胨,0.5%酵母提取物,1%氯化钠)后121 ℃灭菌30 min. 待LB培养基冷却后,按照1%的接种量接入30 mL 活化过夜的茶树内生草螺菌WT00C.发酵条件设定温度34 ℃、转速200 r/min、pH 7.0、通气量为1 vvm、发酵6 h,OD600=1.0即为种子液.随后进行大规模发酵,配制200 L LB液体培养基,加入250 L发酵罐(上海齐瑞生物科技有限公司,QRTN-200)内,在线121 ℃灭菌30 min. 待罐内培养基温度降低至34 ℃时,按照1%的接种量加入种子液. 设定转速为200 r/min、 温度34 ℃、通气量1.0 vvm并发酵12 h.发酵12 h后停止发酵并下罐,OD600值可达 2.2.

1.4 促生剂的制备茶树内生草螺菌小规模发酵或规……