胡诗余，施洁珺，胡济安

NELL-1(neural epidermal growth factor-like 1)是一种促骨、软骨分化的分泌性蛋白，在促进骨组织再生、软骨组织修复方面研究广泛，在组织工程方面有着巨大的应用前景。目前经典的成骨诱导因子BMPs(bone morphogenetic proteins)在应用时具有脂肪生成、异位成骨、天然骨吸收等不良反应[1]，而NELL-1特异性更强、副作用更少，与BMPs联合应用还能产生协同作用。下面对NELL-1促进骨形成和软骨形成的研究进展进行综述。

1 NELL-1蛋白的结构特性和表达

在人类基因组计划下，科学家分离出了NELL-1基因，发现其与一种鸡神经组织高度表达的基因nel有显著同源性，两者编码的肽链均包含6个表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)样序列[2]。随后Ting等[3]在非综合征性单侧冠状颅缝早闭(unilateral coronal synostosis，UCS)患者的颅缝周围组织中发现了NELL-1蛋白表达上调，并猜测NELL-1基因优先表达于颅骨膜内骨和神经组织。NELL-1蛋白包含几个高度保守的功能域，包括1个分泌信号肽、1个NH2端血小板反应蛋白-1样(TSPN)模序、5个血管性血友病因子C(vWC)结构域，以及6个EGF样结构域[2-5]。

这些年来，寻找NELL-1相关的细胞表面特异性受体一直是众多学者的研究目标。接触素相关蛋白样4(contactin-associated protein-like 4，Cntnap4，也称为Caspr4)是一种跨膜神经毒素超家族受体，在神经发育和神经认知中具有重要功能。Li等[6]发现，Cntnap4参与了NELL-1的诱导成骨，而且NELL-1和Cntnap4之间存在高亲和力的配体/受体样相互作用。在小鼠表达Wnt1的细胞中使Cntnap4特异失活，小鼠在新生儿期表现出了与NELL-1缺失小鼠非常相似的颅骨发育异常。以上结果表明NELL-1和Cntnap4在成骨过程中有一条生物学功能轴。值得注意的是：另有研究发现NELL-1与自闭症、躁郁症相关，NELL-1过表达可能会导致发育中的大脑神经细胞大量凋亡，提示NELL-1可能在神经系统中也有潜在的重要作用[6-8]。

NELL-1在所有骨性肿瘤中都有表达，与健康人的骨髓基质细胞相比，骨肉瘤细胞系的NELL-1表达增多[9]。在所有软骨相关肿瘤中，NELL-1表达也增多[10]。而且NELL-1表达水平与肿瘤种类和分级无关[9-10]。虽然NELL-1与肿瘤的关系密切，目前尚不能确认NELL-1究竟是促进肿瘤形成，还是仅仅作为肿瘤标记物存在。

2 NELL-1在成骨方面的调控作用

2.1 NELL-1促成骨分化与骨组织形成

最初有研究发现NELL-1能促进前成骨细胞的成骨分化，但是在成纤维细胞、成肌细胞中，单独的NELL-1并不能诱导其向成骨细胞转化[11-13]。除成骨细胞前体细胞外，NELL-1能明显促进人原代脂肪来源的基质细胞(human primary adipose-derived stromal cell，hASCs)的成骨分化，减少脂肪分化[14]。单独的人类血管周干细胞(human perivascular stem cells，hPSCs)在非骨质疏松模型中能促进大鼠的脊柱融合，而骨质疏松大鼠中hPSCs的促成骨作用大幅下降，不过协同NELL-1能够增强其成骨作用，明确了干细胞和NELL-1的组合可以促进骨质疏松症的骨生长[15-16]。还有研究发现NELL-1同种型NELL-1570能诱导小鼠间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)成骨分化，显著刺激MSCs增殖，并且NELL-1570对细胞增殖的诱导作用具有年龄依赖性，在成年小鼠细胞中表现出明显的诱导作用，但在衰老小鼠细胞中却没有[17-18]。

此外，从啮齿动物到非人类灵长类动物，从骨缺损模型、脊柱融合模型到骨质疏松模型，大量的体内研究证实了NELL-1应用具有诱导骨再生能力，能够明显诱导动物的骨缺损愈合、脊柱融合、改善骨密度，同时抑制脂肪形成，而且NELL-1诱导的骨组织质量与天然骨相似，在非人类灵长类腰椎脊柱融合模型中还有血管增加的现象[19-26]。

而另一方面，体外培养时下调NELL-1能抑制胎鼠颅骨(rat fetal calvarial，RFC)细胞和MC3T3细胞(一种成骨细胞前体细胞)的成骨分化[11]。NELL-1-单倍体不足小鼠经历增龄性的骨质疏松症，其特征是成骨细胞/破骨细胞减小和骨脆性增加[25]。ENU诱导的NELL-1基因缺失的小鼠骨骼系统发育异常，颅骨、颈椎、肋骨、长骨、颌骨都出现了畸形[27]。特异性失活小鼠Col2α1表达细胞的NELL-1(NELL-1Col2α1KO)，产后1和3个月，小鼠表现出侏儒症和早期骨质疏松症[28]。小鼠Wnt1表达细胞的NELL-1特异性失活(NELL-1Wnt1KO)后，小鼠表现出明显的额鼻和下颌骨缺损，另外有5.4%的年轻成年NELL-1Wnt1KO小鼠出现蝶骨内软骨结合过早骨化，额缝、矢状缝和冠状缝变宽[29]。缺乏NELL-1的颅神经嵴细胞(cranial neural crest cells，CNCCs)细胞增殖和成骨分化的能力显著降低，NELL-1对颅顶、颅底和下颌骨的正常发育和生长至关重要[29]。而且有临床病例报告显示：一个3岁的日本女孩身材矮小，相对大头畸形，颅缝闭合延迟，11p14.1-p15.3缺失的基因包括了NELL-1，提示NELL-1在人类骨骼生长发育方面有非常重要的作用[6]。

2.2 NELL-1促成骨分化的调控机制

2.2.1 NELL-1与Runx2/Cbfa1 Runx2/Cbfa1是成骨细胞分化的主要调节因子，能诱导多潜能间充质细胞分化为前成骨细胞，之后β-catenin、osterix和Runx2/Cbfa1使其向不成熟成骨细胞转化，分泌骨基质蛋白[30-32]。

一个骨特异性的cDNA芯片分析揭示，AdNELL-1转导的MC3T3细胞在转导12 d开始矿化时，很多成骨成软骨基因存在明显的表达差异，然而，Runx2、TGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3等的RNA表达没有区别，说明NELL-1可能是以上分子的下游基因[11]。Truong等[33]发现Runx2能与人类NELL-1基因启动子中的3个功能性成骨细胞特异结合元件2(OSE2)结合，并反式激活NELL-1启动子，上调NELL-1基因的表达。这些结果提示NELL-1可能为Runx2的下游靶点，而且可能对骨软骨系分化的细胞有特异性作用。

同时，位于Runx2下游的Osterix对NELL-1的转录又存在抑制作用，能够抑制RNA聚合酶Ⅱ与NELL-1基因的结合，这平衡了Runx2对NELL-1转录的促进作用[34]。

另外，Bokui等[35]发现NELL-1处理过的胎鼠颅骨(rat fetal calvarial，RFC)细胞内ERK和JNK被磷酸化，从而激活Runx2使其被磷酸化，所以Runx2很可能也是NELL-1信号级联反应下游的一个转录因子，NELL-1通过促进其磷酸化来调节其活性，此时Runx2的磷酸化由ERK1/2介导(图1)。NELL-1使Runx2磷酸化可能是一种反馈回路的体现，其目的在于细胞基因表达和功能的更精确调节。

2.2.2 NELL-1与MAPK信号通路 MAPK信号转导途径是将细胞外信号传递并转化为细胞内反应的重要转导通道之一[36]。MAPK信号通路包括ERK、JNK和P38激酶等通路，与成骨细胞分化的分子调控有密切关系。不依赖Smad的Ras-ERK/JNK信号通路主要参与了NELL-1介导的信号转导[4，12-13，37]。对于多种有成骨分化能力的细胞，较低浓度的rhNELL-1蛋白能够短时间激活Ras-MAPK信号级联反应，而RFC细胞中用siRNA介导Ras降解，随后用NELL-1施加刺激，骨桥蛋白(osteopontin，OPN)的产生大量下降，Runx2磷酸化明显减少，这可能是通过有效阻断ERK的激活引起的[35]。另外，特异性JNK抑制剂能够阻断rhNELL-1诱导的Saos-2骨肉瘤细胞矿化，ERK1/2和P38抑制剂却没有这种效应，因此，通过rhNELL-1介导Saos-2骨肉瘤细胞的终末成骨分化，必须激活JNK途径[37]。

2.2.3 NELL-1与Wnt信号通路 James等[25]发现NELL-1通过与整合素β1相互作用，对Wnt/β-catenin信号传导发挥正调节作用。有证据表明，在用NELL-1处理的MSCs中，β-catenin的核定位增加[38]。当Wnt信号传导受到抑制时，NELL-1的成骨作用被破坏[39]。Chen等[29]发现，在NELL-1失活的小鼠CNCCs中，活性β-catenin的水平明显较低，但通过外源性NELL-1蛋白处理，CNCCs成骨能力得以恢复至接近野生型细胞的水平，由此得出结论，NELL-1能够激活Wnt/β-catenin通路，是CNCCs成骨的重要调节因子(图1)。

2.2.4 NELL-1诱导成骨细胞凋亡 细胞凋亡是正常颅骨发育的一部分，并且对骨形成和骨吸收的平衡十分重要，所以凋亡异常可能会导致颅缝的不成熟闭合(颅缝早闭)或者延迟闭合(颅锁发育不全)[40]。NELL-1调节颅骨成骨细胞分化和凋亡，当其表达过度超生理水平时则会扰乱这些平衡，选择性诱导具有矿化潜能的已分化成骨细胞凋亡，从而引起颅面发育异常[41]。Zhang等[8]发现过表达NELL-1，能导致颅盖成骨细胞和神经细胞的大量凋亡，从而诱导小鼠胚胎出现无颅畸形，而这种凋亡与Fas和Fas-L的产生增加有关。

图1 NELL-1在成骨和成软骨过程中的作用机制Fig.1 Mechanism of NELL-1 in osteogenesis and chondrogenesis

2.2.5 NELL-1对BMPs的协同作用 已知经典的成骨诱导因子BMPs在应用时具有脂肪生成、异位成骨、天然骨吸收、软组织炎性肿胀等副作用，使临床应用陷入了一定困境[1]。但是当NELL-1与BMPs结合使用时，NELL-1可以逆转BMPs的促脂肪作用，减弱BMP-2诱导产生的局部炎症反应，从而改善再生骨的质量[42-43]。

最重要的是，NELL-1和BMP-2协同作用还能产生更强的促成骨效应。Liu等[44]发现超低剂量的BMP-2与NELL-1在MSCs的成骨分化中具有协同作用，体外矿化作用更明显。NELL-1和BMP-2联合应用相较BMP-2单独作用，新生骨的骨皮质和骨小梁更厚，骨强度更强，而且没有明显延伸至原来的骨缺损边缘，显著减小了组织体积[39]。目前推测，NELL-1和BMP-2在人类细胞中作用于成骨分化的不同阶段，NELL-1相对作用于成骨阶段后期，刺激骨祖细胞迁移、促进前成骨细胞分化，BMP-2促进骨骼干细胞分化[45]。

Wang等[46]使小鼠胚胎成纤维细胞(iMEF cells)过表达BMP-9、NELL-1或者使NELL-1基因沉默，发现BMP-9能够调控NELL-1表达上调，反过来，NELL-1过表达能够促进BMP-9诱导的晚期成骨分化，抑制早期的成骨标记物和成脂肪标记物表达。但是其研究中单独过表达NELL-1并没能引起明显的成骨分化，这可能与实验所用的iMEFs有关，一定程度印证了NELL-1在分化程度更高的前成骨细胞中更能引起明显的骨化反应。

2.2.6 NELL-1促成骨分化中的RNA网络 Huang等[47]利用RNA测序研究了NELL-1诱导hASCs成骨分化中circRNAs的表达谱，鉴定了两个关键的circRNA，即circRFWD2和circINO80。这两个circRNA在NELL-1诱导的成骨过程中被上调，而敲减它们会影响NELL-1对成骨的促进作用。Yu等[48]将rhNELL-1添加到成骨培养基中以激活hASCs的成骨分化，然后进行了高通量RNA测序，总共检测到1 010个差异表达的miRNAs和1 762个差异表达的mRNAs，并构建了lncRNAs/circRNAs-miRNAs网络，以预测miRNAs的潜在调控作用。生物信息学分析表明，这些差异表达的miRNAs和mRNAs所富集的信号通路正是与成骨分化相关的重要通路。

3 NELL-1在骨组织再生方面的研究进展

3.1 NELL-1局部应用

尽管少量的NELL-1就能够起到骨诱导作用，但是溶液中游离的蛋白很容易由于肽键水解、聚合和扩散的原因而无法作用于局部，加上NELL-1蛋白的半衰期较短，所以为了应用和储存，研发更实用的NELL-1蛋白释放系统很有必要。目前有多种骨诱导支架被研发成功，比如有羟基磷灰石涂层的聚乳酸-羟基乙酸共聚物盘、3D打印的生物活性玻璃块/壳聚糖纳米粒子(BD/CSn)复合物，作为支架装载NELL-1，均能在体内模型中修复骨缺损[21，49]。现在有的支架还能做到控制蛋白释放周期。壳聚糖/羟基磷灰石修饰的TCP颗粒和壳聚糖稳定化的牛血清白蛋白纳米颗粒能较好地控制NELL-1蛋白释放，并可分别达到28 d和8 d的释放周期[50-51]。聚电解质复合物(polyelectrolyte complex, PEC)也能作为NELL-1和BMP-2的缓释载体诱导成骨[44]。

3.2 NELL-1系统性用药

骨质疏松症作为一种系统性疾病，局部给药并不是一种理想的治疗方案，系统性用药的治疗效果反而是最佳的。对于卵巢切除术后的骨质疏松小鼠或NELL-1基因缺陷小鼠，通过小鼠尾静脉注射NELL-1，均可以诱导明显的骨形成[23，25]。然而，药物的体内半衰期和较快的清除速率往往会限制其使用。聚乙二醇化的NELL-1在保持NELL-1促成骨活性的基础上，拥有更好的热稳定性和更长的体内循环时间，降低了用药频率，可以满足骨质疏松症的治疗要求，而且静脉注射和腹腔注射这两种途径均已得到体内实验的证实[52-54]。

除此之外，在小鼠骨折模型中，通过尾静脉注射给药的方式，治疗组小鼠较对照组更早被观察到纤维骨痂形成，骨折处骨密度增加更明显，新生血管也更多，表明NELL-1的聚乙二醇化产物还有促进骨折愈合的作用[55]。

4 NELL-1在成软骨方面的调控作用

NELL-1对于软骨内成骨的促进作用，似乎与软骨发生是相悖的，但是NELL-1敲除不仅能导致成骨能力下降，还显著性降低了软骨相关基因的表达，抑制了软骨细胞增殖和分化[27-28]。NELL-1基因缺失的小鼠存在椎间隙压缩和颈椎曲度异常的颈椎缺陷，暗示NELL-1在椎间盘纤维软骨的发育中有着特殊作用[27]。而NELL-1作用于软骨细胞、hPSCs后，成软骨标记物包括AGGRECAN、COLLAGENⅡ和COMP的mRNA表达水平均能上调[56-57]。另有体外研究发现在3D培养系统扩增兔软骨细胞时，NELL-1能够延长和维持软骨表型，促进软骨细胞增殖和特异性胞外基质的沉积，且没有矿化的胞外基质产生，说明此时NELL-1几乎没有骨诱导作用[57]。体内研究中，在兔股骨髁软骨缺损模型植入NELL-1与壳聚糖纳米颗粒/藻酸盐凝胶载体，结果发现能够形成接近天然软骨的再生软骨[58]。

如今，NELL-1如何正向调控软骨形成的机制仍旧存在较多未知。Li等[59]证实了在成软骨分化和软骨成熟中，NELL-1是Runx2的关键下游靶点，但不像在成骨时NELL-1和Runx2互相有调节作用，软骨形成过程中，NELL-1对Runx2的表达没有影响。尽管NELL-1的表达很大程度上依赖于Runx2，在Runx2缺失的情况下，NELL-1促软骨形成的功能仍旧部分保留。随后，研究证明NELL-1的促软骨形成活性主要依赖于Runx3介导的Ihh信号转导[60]。T细胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells 1，Nfatc1)是介导软骨细胞中的NELL-1→Runx3信号转导的关键因子，可以与Runx3启动子结合，揭示了NELL-1→Nfatc1→Runx3→Ihh级联反应[61](图1)。

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种导致软骨破坏的炎性疾病，现在对于恢复病变关节软骨的结构和功能有着较大的需求。在OA状态下的颞下颌关节内注射NELL-1蛋白，注射12周后Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖mRNA的表达明显高于对照组，提示NELL-1能一定程度上延缓骨关节炎的破坏[62]。Li等[63]发现NELL-1单倍体不足(NELL-1+/6R)小鼠在OA模型中，骨关节炎进展加速且更为严重。值得注意的是，化学诱导OA模型中，NELL-1明显抑制了IL-1β刺激产生的炎症及对关节软骨的损害。从机制上讲，除了其促软骨形成潜力外，NELL-1还通过上调软骨细胞中的Runx1来有效抑制炎症细胞因子及其下游软骨分解代谢酶的表达[63]。因此，对于OA来说，NELL-1有望成为一种具有促软骨形成、消炎双功能的缓解疾病的候选药物。

5 NELL-1应用于软骨组织再生研究进展

利用MSCs进行软骨修复必须解决两方面问题，一是使细胞向软骨细胞方向分化，二是重建新生的胞外基质。Li等[56]用细胞团块法培养hPSCs，并加入不同生长因子以期达到软骨再生，结果NELL-1+TGF-β3+BMP-6的组合相比于TGF-β3+BMP-6能更快地促进hPSCs的成软骨分化，还能避免软骨肥大、纤维化、矿化等常见的副作用。此外，含NELL-1的藻酸盐水凝胶也能明显促进兔股骨髁软骨的缺损愈合[58]。

正如前文提到的，由于较短的半衰期和较快的降解速率，直接应用NELL-1蛋白不够有效，但壳聚糖微颗粒可以持续释放NELL-1，以使NELL-1的成软骨潜能发挥最大化[57-58]。

6 展 望

NELL-1作为一种具有特异性诱导成骨和成软骨的细胞因子，相较于经典的成骨诱导因子BMP2，安全性更高、副作用更少，在组织工程的应用领域有非常可观的远景。目前已有很多研究证实了NELL-1在骨/软骨缺损、骨质疏松症、骨关节炎方面的治疗潜力，但是对于NELL-1诱导软骨形成的机制研究尚处于起步阶段，我们期待在成软骨领域能有更多的研究发现。而作为组织再生领域的新星，NELL-1在应用中是否有促肿瘤形成的危险性，也需要研究者进一步的关注。另外，近年来有研究提示NELL-1在神经系统中可能存在重要作用，探索NELL-1在神经系统中的作用机理将是未来大有意义的研究方向。