梁天坚李黎明李本杰秦燕琼吕金燕曹 云陈 睿*梁 燕

（1.广西中医药大学基础医学院，广西 南宁 530001；2.广西中医药大学赛恩斯新医药学院，广西 南宁 530222；3.广西医科大学药学院，广西 南宁 530021）

高脂血症（Hyperlipidemia，HLP）是导致心脑血管疾病的重要诱因，其发生发展多与患者饮食、作息及情志等多方面因素有关［1]，当前治疗多用西药干预，但常伴有一定不良反应，因此，需要寻找更为安全有效的方法［2]。大柴胡汤是中医经典名方，由柴胡、黄芩、大黄、枳实、半夏、白芍、大枣、生姜组成［3]，临床治疗HLP 具有显著疗效［4-5]。

网络药理学（Network pharmacology）基于系统生物学及药理学范畴，通过构建药物与靶点、靶点和疾病等之间的关联互作网络，从整体来预测中药活性成分及其药理机制［6-7]，这一整体网络策略十分契合中药整体作用特点，与中药精准应用的过程一致。

为了进一步研究大柴胡汤治疗HLP 的作用机制，本研究拟通过网络药理学发现大柴胡汤的活性成分-关键靶标-信号通路的关联性，发掘其治疗HLP 的作用机制，以期为该方临床精准应用提供方法支持和理论依据。

1 方法

1.1 活性成分筛选和潜在靶点收集 利用TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）数据库［8]，收集大柴胡汤组方中各单味药的化学成分并进行ADME 分析，根据口服利用度（OB≥30%）和类药性（DL≥0.18）初步筛选出该复方的主要活性成分，收集活性成分对应的潜在药效靶点，并利用Uniprot 数据库，将靶点名称（Protein name）统一为基因名称（Gene name）。

1.2 HLP 作用靶点的预测与筛选 以“hyperlipidemia”为关键词，利用人类基因组注释数据库［9]Genecards（https：//www.genecards.org）和NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）数据库［10]进行检索，获取HLP相关疾病靶标。将疾病靶标与上述活性成分潜在药效靶点相匹配，所得共同靶标即为潜在作用靶点。

1.3 蛋白互作网络构建及核心靶点筛选 利用String（https：//string-db.org/）在线数据库［11]对大柴胡汤治疗HLP 潜在靶蛋白之间相互作用（Protein protein interaction，PPI）进行分析，选择关联度大的互作蛋白作为核心靶点，并利用Cytoscape3.7.1 网络可视化软件构建PPI 网络。

1.4 GO 基因功能注释和KEGG 通路富集分析 将PPI 网络中筛选所得核心靶点导入生物学信息注释数据库［12]DAVID 6.8（http：//david.Ncifcrf.gov/）中进行基因本体（Gene ontology，GO）注释分析和京都基因与基因百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，并限定靶基因名称列表为人。

1.5 网络模型构建及分析 将收集到的活性成分及其潜在靶点筛选结果，利用Cytoscape3.7.1 网络可视化软件构建“活性成分-靶点”（Compound-Target，C-T）网络图；根据KEGG 通路富集分析结果中P 值大小，选择显著富集的前15 条信号通路，构建“活性成分-靶点-通路”（Compound-Target-Pathway，C-T-P）网络图。基于度值（degree）和介数（betweenness）设置节点（node）颜色和大小，活性成分与其作用靶点、靶点与其相关信号通路之间用边（edge）相连，以反映大柴胡汤治疗HLP 的主要活性成分及其潜在作用靶点和相关通路。

1.6 分子对接验证活性成分-核心靶点 基于上述分析结果，选择关联度最高的活性成分作为配体，KEGG 富集结果中最为显著的信号通路所涉及靶点蛋白作为受体，经RCSB Protein Data Bank（http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do）平台［13]筛选并下载关键蛋白及其共结晶，利用Sybyl2.0 软件对受体蛋白及配体小分子进行准备工作，删除水分子，添加极性氢原子，构建活性口袋，选择柔性对接模式，对活性成分与核心靶蛋白进行分子对接。对接结果利用LigPlus 软件进行分析，其氢键和疏水键，预测二者的结合性能，从而验证本研究结果的可靠性。

2 结果

2.1 活性成分筛选及潜在靶点预测 经TCMSP 数据库筛选，共收集到大柴胡汤活性成分133 种，有9 种共有成分，均表现出较高的口服生物利用度和类药性。其中，柴胡活性成分17 种，黄芩活性成分36 种，大黄活性成分15 种，枳实活性成分22 种，半夏活性成分13 种，白芍活性成分13 种，大枣活性成分29 种，生姜活性成分5 种，具体信息见表1。

表1 大柴胡汤活性成分

续表1

通过TCMSP 数据库预测得到柴胡的潜在作用靶标314个，黄芩507 个，大黄306 个，枳实306 个，半夏174 个，生姜75 个，大枣281 个，白芍123 个，得到大柴胡汤133 种活性成分对应的潜在作用靶点288 个，共有靶标见表2。

表2 大柴胡汤所含中药之间的共有靶标数量（个）

2.2 疾病靶点筛选及PPI 网络构建 经Genecards 数据库和NCBI 数据库检索，共得到249 个HLP 相关疾病靶标，将以上249 个疾病靶标与大柴胡汤活性成分相对应的288个潜在作用靶点取交集进行分析，得到55 个共有靶标（图1），共有靶标即为大柴胡汤治疗HLP 的潜在作用靶点。将55 个潜在靶点信息导入STRING 数据库，物种选择“Homo sapiens”，以蛋白相互作用综合得分＞0.9 作为筛选条件，得到46 个靶点的蛋白互作结果，将结果文件导入Cytoscape

图1 大柴胡汤疾病-成分靶点韦恩图

3.1.1 软件，构建上述46 个靶点的PPI 网络（图2），各靶点信息见表3。

表3 大柴胡汤治疗HLP 核心靶点

图2 大柴胡汤治疗HLP 作用靶点PPI 网络

2.3 活性成分-核心靶点网络构建 运用Cytoscape 3.1.1软件将筛选所得大柴胡汤活性成分及其治疗HLP 相关联的核心靶点相连构建“活性成分-靶点”（C-T）网络图，如图3 所示，网络中共包含119 个节点nodes（73 个活性成分和46 个核心靶点）；左边蓝色节点代表活性成分，右边红色节点代表靶点，而边则表示活性成分与靶点的相互作用关系。表4 所示为大柴胡汤治疗HLP 活性成分及核心靶点的网络度和介数值，其中MOL000098（quercetin）度数最大（31 个节点），其次是MOL000422（kaempferol）有28个节点、MOL000358（β-sitosterol）有18 个节点，为3 个主要活性成分；4 个主要靶点基因，包括PTGS1（67 节点）、NOS2（29 节点）、F2（25 节点）、ESR1（23 节点）。

表4 大柴胡汤治疗HLP 活性成分及核心靶点的网络度和介数值

图3 大柴胡汤治疗高脂血症C-T 网络图

2.4 GO 基因功能注释分析和KEGG 通路富集分析 将46个核心靶点导入DAVID 数据库进行GO 基因功能注释分析和KEGG 通路富集分析，共映射到172 个GO term，包括124 个生物过程（Biological Process，BP）、19 个细胞组分（Cellular Component，CC）和29 个分子功能（Molecular Function，MF）。按照P 值大小（P＞0.01），挑选出最显著富集的15 个GO term 进行作图，结果如图4 所示。在分子功能中，丝氨酸内肽酶活性（serine-type endopeptidase activity）和血红素结合（heme binding）相关性最大；在细胞组分中，细胞外空腔（extracellular space）和细胞表面（cell surface）相关性最大；在生物过程中，葡萄糖稳态（glucose homeostasis）与蛋白质磷酸化正调控（positive regulation of protein phosphorylation）相关性最大。

图4 GO 富集图

通过KEGG 富集分析，活性成分潜在药效靶点共参与48 条信号通路，根据P 值大小（P＞0.01），挑选出最显著富集的15 个KEGG 通路进行作图，获得相关基因31 个。如图5 所示，最显著富集的通路是HIF-1 signaling pathway、TNF signaling pathway 和Insulin resistance，相关靶点包括AKT1、SREBF1、PPARA、IL6、TNF、SLC2A4、NOS3、PTPN1、INSR、HIF1A、VEGFA、SERPINE1、NOS2、VCAM1、CCL2、MMP9、MMP3、SELE。

图5 KEGG 富集图

2.5 活性成分-靶点-通路网络构建 为了直观地反映活性成分与靶点和主要通路之间的关系，根据KEGG 通路富集分析结果，选择富集度最高的前15 条信号通路为研究对象，采用Cytoscape3.7.1 软件构建大柴胡汤治疗HLP“活性成分-靶点-主要通路”（C-T-P）网络模型。如图6 所示，大柴胡汤8 个组分（橙色节点）的52 个活性成分（蓝色节点）共对应到30 个潜在作用靶点（绿色节点），主要生物信号通路15 条（黄色节点），节点颜色越深表示与此节点相连的边越多，它的度数越大，节点也就越大。从C-TP 网络可以发现，活性成分MOL000098（quercetin）作为关联度最高的活性成分，可作用于NOS2、F2、ESR1、AKT1 和F7 等多个高关联靶点，涉及多条信号通路，各靶点相互协调，共同参与其药理作用的发挥。

图6 大柴胡汤治疗高脂血症C-T-P 网络图

2.6 分子对接验证关键通路 通过GO 基因功能注释分析和KEGG 通路富集分析，得到最显著富集的通路是HIF-1 signaling pathway，相关基因 IL6、HIF1A、VEGFA、SERPINE1、NOS3、NOS2、INSR、AKT1，与关联度最高的5 种活性成分槲皮苷（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、汉黄芩素（wogonin）、毛地黄黄酮（luteolin）和异鼠李素（isorhamnetin）进行分子对接，结果如表5 所示，可知5 种活性成分与HIF-1 signaling pathway 的绝大部分相关基因获得较好的对接分数，验证了本研究结果的可靠性。

表5 分子对接结果

NOS2 靶点是C-P-T 网络图的核心节点，分子对接结果显示，关联度最高的5 种活性成分与NOS2 对接活性均高于其他靶点。其中，关键节点quercetin（槲皮苷）能稳定地接入NOS2 蛋白的活性口袋，通过与蛋白活性中心口袋的卟啉基团和GLU377 氨基酸形成分子间氢键，与PRO350、TYR373 和VAL352 形成分子间疏水键，维持NOS2 蛋白活性口袋的稳定，如图7 所示。

图7 活性成分quercetin（槲皮苷）与NOS2（PDB：2nsi） 相互作用的分子对接图

3 讨论

高脂血症可直接引发多种严重危害人体健康的疾病，如动脉粥样硬化、冠心病、胰腺炎等，中医通常采用健脾益气、补益肝肾、化湿泄浊、祛瘀化痰等方法进行治疗［14]。大柴胡汤为治疗少阳阳明合病方，有清利肝胆、通腑泄浊、和中健脾的作用，因此很多医家用其治疗高脂症，并取得很好的疗效［15]。本研究通过TCMPS 数据库，筛选出大柴胡汤8 种组分的化学成分133 个，大柴胡汤相对应的疾病靶点288 个，通过共有靶标分析，8 味中药均存在多个共同靶标，说明它们之间存在多种协同或拮抗作用，多味药中不同的化学成分可以相继与靶点分子结合，形成叠加效应共同发挥作用，不同的靶点又可能隶属同一通路，彼此交织形成网络，可能是大柴胡汤治疗高血脂症的原因所在。

通过口服利用度和类药性筛选，得到大柴胡汤活性成分133 个，槲皮苷在C-T 网络和C-T-P 网络中均为关键节点，并且经过分子对接证明了其与对多个关键靶标均具有良好的对接活性。槲皮苷是一种黄酮类单体化合物，广泛存在于植物中，药理研究表明，其具有降血糖、降血脂、抗氧化和抗肿瘤等多种药理作用［16]，邢影等［17]发现槲皮苷能显著降低高脂血症大鼠血清和肝脏中总胆固醇和甘油三酯水平，调节高脂血症大鼠的血脂代谢，抑制肝脏脂肪沉积。

通过对大柴胡汤C-T 网络、C-T-P 及PPI 网络进行分析，认为PTGS1、NOS2、VEGFA、IL6 等靶点是大柴胡汤治疗高血脂症的关键靶点。PTGS1（环氧化酶），可调节花生四烯酸类物质的生成，后者调节可促进血管壁动脉粥样硬化和血栓形成的生理过程，包括血小板聚集、控制血管张力及局部炎症反应［18]。NOS2（一氧化氮合酶）和IL6（白细胞介素6）是两个重要的炎症因子，研究表明高血脂症与主要炎症因子具有一定相关性，常一川等研究发现大柴胡汤对高脂高胆固醇大鼠心肌组织内TNF-α、IL-6 蛋白表达均显著上调［19-20]；VEGFA（血管内皮生长因子A）是PDGF/VEGF 生长因子家族的成员，在血管生成、血管发生和内皮细胞生长中发挥重要作用，可以诱导内皮细胞增殖、促进细胞迁移、抑制凋亡并诱导血管通透性，可以调节脂肪组织分化、基因表达和生物学功能的平衡［21]。

经GO 基因功能注释，发现大柴胡汤活性成分对葡萄糖稳态、蛋白质磷酸化的正调控、巨噬细胞衍生泡沫细胞分化的负调控、脂多糖介导的信号通路和胆固醇代谢过程等生物学过程有一定影响，并在大柴胡汤治疗高血脂症所涉及的作用靶点及相关通路中有所体现。KEGG 通路富集显示，HIF-1 signaling pathway（低氧诱导因子1 信号通路）、TNF signaling pathway（肿瘤坏死因子信号通路）和Insulin resistance（胰岛素抵抗）通路是主要的富集通路，研究表明，通过HIF-1 signaling pathway 可以调节HIF-1 的活性，能激活多种缺氧反应基因的表达，组织缺氧可诱导HIF-1的活性上调并激活其下游因子内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的高表达，促进血管内皮细胞的增殖和分化，减小高血脂症对血管内皮细胞的损失［22]；TNF signaling pathway 中的TNF-α 是脂肪细胞的分泌产物之一，其可促进前体脂肪细胞、脂肪细胞凋亡，抑制前体脂肪细胞分化，抑制脂肪合成，也可以刺激脂肪细胞脂质分解加速，导致游离脂肪酸升高，并抑制胰岛素信号通路，导致胰岛素抵抗［23-24]；Insulin resistance 与高血脂症关系密切，高血脂患者容易导致胰岛素抵抗，同时，胰岛素抵抗使胰岛素靶细胞对胰岛素不敏感，血浆葡萄糖不能被靶细胞摄取导致血浆葡萄糖水平升高，机体需要摄取血浆中过多的葡萄糖合成脂肪储存于靶细胞，维持着糖代谢平衡，引起高血脂症［25-26]。

综上所述，本研究利用网络药理学方法挖掘大柴胡汤治疗高血脂症的活性成分，通过网络构建及通路富集阐述了活性成分与作用靶点和通路之间的联系，揭示了大柴胡汤治疗高血脂症的潜在分子机制，为该方临床应用及深入研究提供了理论依据。