程婉秋王丽苹曾芷筠江 涛 陈艳芬张祉思侯 捷唐春萍

（1.广东药科大学中药学院，广东 广州 510006；2.广东药科大学实验动物中心，广东 广州 510006；3.广州市新药筛选模型体系构建与应用重点实验室，广东 广州 510006；4.广东省局部精准药物递药制剂工程技术研究中心，广东 广州 510006）

慢性鼻窦炎（chronic rhinosinusitis，CRS）是鼻窦与鼻腔黏膜的慢性炎症，病程长，为耳鼻咽喉科常见慢性病之一［1]。CRS 的病理机制较复杂，研究表明CRS 中环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）的表达受NF-κB 信号转导通路调控，NF-κB 可通过增强细胞因子（如IL-6、IL-8）表达，刺激抗凋亡基因的转录，引起鼻黏膜慢性炎症［2-4]。鼻窦灌注液为临床经验方［5]，具有温阳益气，祛浊通窍的功效。本研究通过观察鼻窦灌注液对慢性鼻窦炎家兔模型血清中炎性因子和鼻黏膜COX-2 及NF-κB 的影响，探讨鼻窦灌注液治疗CRS 的作用机制。

1 材料

1.1 动物 健康新西兰大白兔56 只，体质量2.0～3.0 kg，购于广东省花都区花东信华实验动物养殖场，动物生产许可证号SCXK（粤）2014-0023。

1.2 菌株 肺炎链球菌（临床菌株，编号SPN-17003-W1），由广东莱恩医药研究院有限公司赠予。

1.3 药物与试剂 鼻窦灌注液（批号17042801）购自广州花海药业股份有限公司；鼻渊舒口服液（批号170615）购自成都泰和健康科技集团股份有限公司华神制药厂。哥伦比亚培养基（批号20161108）购自青岛海博生物技术有限公司；无菌脱纤维羊血（批号180102）购自广州鸿泉生物科技有限公司；Trizol 试剂盒（批号9109）购自北京宝日医生物技术有限公司；BestarTM qPCR RT kit 试剂盒（批号2220）、BestarTM qPCR MasterMix 试剂盒（批号2043）购自美国DBI 公司；DEPC（批号6079）购自上海麦克林生化科技有限公司；IL-6 试剂盒（批号ARB13577）、IL-8试 剂盒（批号 ARB12173）、TNF-α 试剂盒（批号ARB2489）、COX-2 试剂盒（批号ARB52237）购自北京白奥莱博科技有限公司。

1.4 仪器 额戴反光镜（丹阳市健陵医疗器械有限公司）；医用电钻（上海金炜五金机械有限公司）；恒温培养箱（广州合众生物科技有限公司）；膨胀海绵（广州市快康医疗器械有限公司）；超净工作台（苏州净化设备公司）；超微量紫外分析仪（美国Quawell Technology 公司）；紫外透射分析仪（上海嘉鹏科技有限公司）；核酸电泳仪（北京六一仪器）；台式低温高速离心机（珠海黑马公司）；迷你混匀仪（广州四亿科学仪器有限公司）；旋涡混合器（上海精科实业有限公司）；Stratagene Real time PCR 仪（美国Agilent 公司）；PCR 扩增仪（杭州晶格科学仪器有限公司）。

2 方法

2.1 菌种的制备 取肺炎链球菌临床菌株（编号SPN-17003-W1），划线法接种至哥伦比亚绵羊血平板上，置35 ℃恒温培养箱内培养18～24 h，观察菌落生长状况。培养两代后得到生长旺盛的菌株，用无菌生理盐水稀释，比浊法调成1×108克隆形成单位（CFU）/mL 的细菌悬液备用。

2.2 造模、分组与给药 采用宾骥［6]报道的窦口不完全堵塞+留置棉球+肺炎链球菌的造模方法建立慢性鼻窦炎家兔模型。除空白组外，其余动物用戊巴比妥钠（0.03 g/kg）耳缘静脉麻醉，沿鼻背正中线切一纵长切口，随机选取一侧上颌窦前壁，分离皮下组织及骨膜，用医用电钻（1 mm钻头）在上颌窦前壁钻开一大约1.5 mm 小孔，取已制备3 mm×5 mm×25 mm 大小医用膨胀海绵通过上颌窦前壁所钻的小孔，将其置放在窦口及窦腔中，不必完全堵塞窦口，碘伏消毒手术创面，将骨膜、皮肤逐层缝合。用1 mL 注射器抽取1 mL 细菌悬浊液，小心缓慢通过小孔注入各造模组，假手术组注入等量的生理盐水，每周造模1 次，共3次，造模4 周后按鼻窦炎总评分标准再将模型动物随机分为模型组、阳性组（鼻渊舒口服液4 mL/kg）及鼻窦灌注液低、中、高剂量组（1.2、2.4、4.8 g/kg），空白组、模型组、假手术组给予等量生理盐水，经鼻给药，每天上、下午各1 次，每次给药间隔约4～6 h，连续4 周。

2.3 一般情况及主要症状体征观察 观察各组新西兰兔造模前后及治疗前后的精神状态、毛色、活动情况、进食进水量、体质量变化及鼻塞、喷嚏、脓涕等主要症状，鼻窦炎症状评分标准［7]见表1。

表1 鼻窦炎症状评分标准

2.4 鼻黏膜组织形态学观察及评分 耳缘静脉采血后耳缘静脉空气针处死家兔，将鼻黏膜剥离，使用4%多聚甲醛溶液固定鼻窦黏膜标本，48 h 后进行脱水、石蜡包埋、切片、HE 染色，光学显微镜观察各组上颌窦黏膜假复层纤毛上皮排列，腺体分布排列，杯状细胞数量，炎细胞浸润等病理变化。

鼻黏膜炎症按以下方法进行评分［8]，根据光镜下观察计数鼻窦黏膜间质炎性细胞的数目进行病理分级。（1）无明显的炎症，黏膜间质无炎细胞浸润（评分0 分）；（2）轻度的炎症，黏膜间质内炎细胞很少（评分1 分）；（3）中度的炎症，黏膜间质内有较多的炎细胞（评分2 分）；（4）显著/严重的炎症，黏膜间质内大量炎细胞浸润（评分3 分）。

上皮细胞损伤的分级方法按Ponikau 等的分级法。0级：纤毛完整无损伤；1 级：无明显上皮细胞脱落，但有部分纤毛缺失；2 级：上皮细胞剥脱，但是无基底膜暴露；3 级：上皮细胞全部剥脱，基底膜暴露。

杯状细胞增生评分按照杯状细胞占纤毛上皮细胞比例为0 分，＜1/10；1 分，2/10；2 分，3/10；3 分，＞4/10。

2.5 IL-6、IL-8、TNF-α、COX-2 水平测定 末次给药1 h，耳缘静脉取血2 mL，3 000 r/min 离心15 min，分离血清，于-80 ℃保存备用。严格按照ELISA 试剂盒说明进行操作。

2.6 荧光定量PCR 末次给药1 h，3% 戊巴比妥钠麻醉（10 mL/kg），取各组家兔鼻黏膜组织50 mg，按试剂盒说明进行。以Trizol 试剂提取RNA，利用OligoTMPrimer Analysis 软件在新西兰兔组织因子基因序列上设计定量引物，检测COX-2 mRNA 和NF-κB mRNA 的表达，以β-actin做内参。引物序列如下： COX-2 引物，正向5′CCACCTCTGCGATGCTCTTC3′，反向5′CTGGTCAAATCCTGTGCTCATAC3′；NF-κB 引物，正向5′AAGCCTTCCCGAAGTGCGT3′，反向5′ACCTCCGAAAGCGAGATAAAGA3′；β-actin 引物，正向5′ATGACCCAGATCATGTTTGA3′，反向5′TACGACCAGAGGCATACAG3′。以2 μg 总RNA 为模板，按照Bestar qPCR RT Kit 说明书配制逆转录反应体系，总体系为10 μL，合成cDNA 链。Real time PCR 扩增的反应体系为20 μL，PCR 反应条件为95 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃20 s，40 循环。融解曲线分析为94 ℃30 s，65 ℃30 s，94 ℃30 s，每个样重复3 次。

2.7 统计学分析 采用SPSS 21.0 软件进行分析，数据均以（）表示，组间比较采用单因素方差分析。 P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 一般情况及主要症状体征观察 造模和给药期间，动物的活动量、饮食和饮水量减少。造模4 周后，与假手术组比较，空白组各症状评分值无统计学差异（P＞0.05），模型组轻擦鼻、喷嚏、鼻腔分泌物、鼻腔炎症和总评分有统计学差异（P＜0.01），见表2，提示CRS 造模成功。与模型组比较，给药2 周后，鼻窦灌注液各剂量组和阳性组各症状总评分值降低（P＜0.05，P＜0.01）；给药4 周后，鼻窦灌注液高、中剂量组和阳性组各症状总评分值降低（P＜0.05，P＜0.01）。见图1。

图1 鼻窦灌注液对家兔CRS 症状总评分的影响（n=8）

表2 造模4 周后肺炎链球菌致家兔CRS 各症状评分（分，）

表2 造模4 周后肺炎链球菌致家兔CRS 各症状评分（分，）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01。

3.2 对鼻黏膜组织形态学的影响 空白组鼻窦黏膜假复层纤毛上皮细胞结构完整，纤毛排列整齐，偶见少量杯状细胞，黏膜下层无明显炎症细胞浸润；假手术组鼻黏膜上皮组织表现与空白组相似，纤毛排列整齐，偶见少量杯状细胞，黏膜下层无明显炎症细胞浸润；模型组鼻窦黏膜呈慢性炎症表现，黏膜假复层纤毛上皮细胞结构缺失，炎症细胞浸润明显，可见造模成功；阳性组鼻窦黏膜假复层纤毛上皮细胞结构完整，纤毛排列整齐、少量缺失，炎症细胞浸润程度低于模型组；鼻窦灌注液低剂量组鼻窦黏膜组织表现与模型组相似，假复层纤毛上皮细胞结构缺损、排列紊乱，纤毛缺失，杯状细胞较多；鼻窦灌注液中剂量组假复层纤毛上皮细胞结构部分缺损、排列稍整齐，杯状细胞数目少于鼻窦灌注液低剂量组，炎症细胞浸润减轻；鼻窦灌注液高剂量组鼻窦黏膜组织表现纤毛结构基本完整，排列整齐，偶见杯状细胞，炎症细胞浸润程度低于鼻窦灌注液中剂量组。见图2、表3。

表3 鼻窦灌注液对家兔CRS 模型鼻黏膜组织形态学评分的影响（分，，n=8）

表3 鼻窦灌注液对家兔CRS 模型鼻黏膜组织形态学评分的影响（分，，n=8）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

图2 鼻窦灌注液对家兔CRS 模型鼻黏膜组织形态学的影响（×100）

3.3 对血清IL-6、IL-8、TNF-α、COX-2 水平的影响 与假手术组比较，空白组IL-6、IL-8、TNF-α、COX-2 水平无变化（P＞0.05）；与模型组比较，鼻窦灌注液高剂量组和阳性组能够降低血清中IL-6 水平（P＜0.05），鼻窦灌注液中、高剂量组和阳性组能够降低血清中IL-8 水平（P ＜0.01），鼻窦灌注液各剂量组和阳性组能够降低血清中TNF-α、COX-2 水平（P＜0.05，P＜0.01）。见图3。

图3 鼻窦灌注液对家兔CRS 模型血清中炎性因子的影响（n=8）

3.4 对鼻黏膜中COX-2 和NF-κB mRNA 表达的影响 与假手术组比较，模型组COX-2、NF-κB mRNA 表达升高（P＜0.01）；与模型组比较，鼻窦灌注液各剂量组COX-2、NFκB mRNA 表达降低（P＜0.01）。见图4。

图4 鼻窦灌注液对家兔CRS 模型鼻黏膜中基因表达的影响（n=8）

4 讨论

CRS 属于中医学“慢性鼻渊”范畴，是以鼻流黄脓涕或浊而量多，鼻窍不通，嗅觉减退，头痛为主症［3]。近年来中医药在CRS 的治疗方面通过辨证论治、内外合治、中西医结合以及针药配合等方法的综合运用，在改善患者证候症状、提高生活质量方面取得了很大的进步。鼻窦灌注液是由广州中医药大学第一附属医院的王德鉴教授根据多年临床实践自拟，该方由黄芪、淫羊藿叶、桂枝、辛夷花、白芷、野菊花、薄荷、红花、当归等药组成，具有温祛风、消炎解毒、调和气血的功效［5]。本方选用温阳活血的中药组方并首创以洗鼻剂作为给药剂型，灌注入鼻可促进鼻窍脉络血流通畅，达到通鼻窍，排除涕的作用。

NF-κB 是主要以p50/p65 异源性二聚体形式普遍存在于细胞质中的核转录因子，具有多项转录调节功能。在正常的生理情况下，NF-κB 与其抑制蛋白（inhibitors of kappaB protein，IκB）结合，形成异源三聚体（p50-p65-IκB），以无活性非DNA 结合形式存在于细胞质中。当细胞受到刺激时，NF-κB 抑制蛋白IκB 的上游激酶即IκB 激酶（IκB kinase，IKK）活化，使IκB 磷酸化而失活，活化的NF-κB 从细胞质异位至细胞核内，与特定的κB 序列结合从而诱导相关基因表达，如引起炎症介质表达和释放［9]。炎症介质可以反作用激活NF-κB，从而引起正反馈作用，使得炎症反应加重［10]。受NF-κB 调控的基因表达产物囊括了大多数参与炎症形成的主要细胞因子和炎症介质，如TNFα，白细胞介素、黏附分子等，且NF-κB 活化还可调控COX-2 的表达［11-12]。

COX-2 是一种诱导型酶，正常生理情况下呈不表达或低表达状态，在组织损伤或炎症情况下可在一系列胞内和胞外促炎症细胞因子如白细胞介素、肿瘤坏死因子等刺激下迅速表达，导致大量的花生四烯酸转化为前列腺素，引起慢性炎症［3]。炎症反应中，COX-2 是NF-κB 的靶基因，且NF-κB 是COX-2 上游信号转导途径之一［13]。研究发现，IL-6、IL-8 及TNF-α 同时参与了CRS 黏膜炎症发生和发展，是CRS 中非常重要的三个炎症细胞因子［14]。Wang 等［15]研究发现，CRS 患者的鼻黏膜被大量炎症细胞浸润，IL-6、IL-8、TNF-α 等多种炎性细胞因子以及氧自由基生成增多，导致细胞膜结构受损，引发大量炎症介质释放。TNF-α 可上调IL-8 的表达，能促进炎症细胞因子参与炎症反应的发生、吸引中性粒细胞和单核巨噬细胞等炎症细胞的聚集，进而引发炎症介质之间的级联反应［16]。李岩等［17]应用RTPCR 发现CRS 模型家兔鼻黏膜中IL-8 mRNA 和TNF-α mRNA 表达增高，显示IL-8 和TNF-α 参与了CRS 的发病过程。IL-6 是重要的促炎因子，可与TNF-α 等发挥协同作用，促使炎症介质网络形成，引起细胞损害。Kim 等［18]研究发现CRS 患者鼻黏膜中IL-6 的表达与正常人相比显著性升高。

本实验结果显示，鼻窦灌注液各剂量组和阳性组降低了家兔主要症状评分值及总评分值，并改善了鼻黏膜组织的形态学变化，也降低了血清中IL-6、IL-8、TNF-α 和COX-2 的水平以及鼻黏膜中COX-2 mRNA 和NF-κB mRNA的表达，表明COX-2、NF-κB、IL-6、IL-8 以及TNF-α 参与了CRS 的炎症反应过程，且鼻窦灌注液可能通过阻断NFκB 信号通路来减少COX-2、IL-6、IL-8、TNF-α 的表达，限制炎症反应，减轻鼻黏膜炎症，达到治疗CRS 的目的。鼻窦灌注液对CRS 有治疗作用，其机制可能是通过NF-κB 信号转导途径调控COX-2 的表达，抑制炎性细胞因子生成从而发挥抗炎作用。