马天鹏，李 想，林 丹，谢毅强*

（1.海南医学院，海南 海口 571199；2.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025）

食管癌是常见的恶性肿瘤，2018 年全世界约有57.2 万例新发病例和50.9 万例死亡病例［1]。转移是实体瘤的一个主要恶性生物学行为，因为这种现象与不良预后密切相关，并且导致大多数癌症相关死亡［2]。目前认为，肿瘤转移仍然是食管癌相关死亡的主要原因，因此，有必要鉴定或开发具有抗转移能力的药物用于其治疗。

肿瘤转移是一个多步骤的过程，细胞外基质降解就是其主要步骤，而基质金属蛋白酶（MMPs）在这个过程中起着不可或缺的作用［3]。PI3K/Akt 通路过度激活常存在于食管癌中，并与肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭过程均相关，已有研究证明它通过促进MMPs 的分泌而促进肿瘤转移［4]。PI3K/Akt 途径的激活可以影响多种细胞外信号，包括哺乳动物雷帕霉素受体蛋白（mTOR）途径的激活。因此，PI3K/Akt/mTOR 是抑制食管癌转移的一个重要通路。

姜黄素是从姜黄Curcumin 属植物根茎中提取的一种天然植物多酚。姜黄素具有多种药理作用，如抗炎、抗氧化、抗血管生成、镇痛和抗菌作用［5]。先前的研究表明，姜黄素具有广泛的抗肿瘤作用［6-8]。除抗癌特性外，姜黄素因其低毒性和患者的良好耐受性被认为是一种安全的化合物，表明姜黄素有潜力成为一种新型的抗癌剂。但鲜有食管癌相关研究的报道，因此，本研究首先观察姜黄素对食管癌细胞的影响，尤其是其侵袭和迁移能力的改变，并对其潜在机制进行探讨。

1 材料

1.1 药物与试剂 人食管鳞癌细胞株Kyse-150 由中国医学科学院医学研究所细胞中心提供。姜黄素（货号458-37-7，纯度≥98.0%）购自上海诗丹得生物技术有限公司，经二甲基亚砜（DMSO）溶解成母液，储存于-20 ℃，后经完全培养基稀释至实验所需浓度，于4 ℃保存备用；CCK-8 试剂盒购自上海东仁实业有限公司；逆转录和荧光定量试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；胎牛血清和RPMI 1640 培养基购自美国Gibco 公司；Transwell 小室和Matrigel 胶购自美国Corning 公司；总RNA 提取试剂购自宝日医生物技术（北京）有限公司；BCA 蛋白定量试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；β-actin、基质金属蛋白酶9（matrix metalloprotein 9，MMP-9）和基质金属蛋白酶2（MMP-2）兔抗人单克隆抗体及HRP 标记的二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；Akt、p-Akt（Ser473）、mTOR和p-mTOR（Ser2448）购自英国Abcam 公司。

1.2 仪器 全自动全波长酶标仪购自美国MD 公司；实时荧光定量PCR 仪购自美国Thermo 公司；电泳仪、凝胶成像系统购自美国Bio-Rad 公司。

2 方法

2.1 细胞培养 食管癌Kyse-150 细胞用RPMI 1640 培养基放在37 ℃、含5% CO2加湿培养箱中培养，培养基内添加10%的胎牛血清和1%的青霉素、链霉素。待单层细胞融合度达80%～90% 时，进行常规细胞消化、传代，以进行后续实验。

2.2 CCK-8 法检测细胞增殖抑制 CCK-8 法测定姜黄素细胞毒性。Kyse-150 细胞接种在96 孔板中（3×103/孔），在37 ℃、含5% CO2的培养箱中孵育过夜，并加入不同浓度（10～160 nmol/L）的姜黄素处理24、48 h。同批细胞经含0.1% DMSO（经预实验证实其对细胞生长无明显影响）的培养液处理后作为对照组。随后，向每个孔中加入10 μL CCK-8 溶液继续培养4 h，使用酶标仪在450 nm 处测量光密度值（OD），并设定对照组细胞存活率为100%，抑制率=［1-（OD实验组-OD空白组）/（OD对照组-OD空白组）] × 100%。

2.3 划痕愈合实验检测细胞平面迁移能力 将Kyse-150细胞接种于6 孔培养板（1×106/孔）中培养24 h，生长良好的单层细胞用200 μL 移液器尖端划伤，用PBS 洗去不黏附的细胞。加入含10、20 nmol/L 姜黄素的完全培养基分别处理24、48 h，倒置显微镜下每孔选择5 个视野，拍摄划痕伤口的图像。

2.4 Transwell 小室法检测细胞侵袭和迁移能力 用无血清培养基将常规培养的Kyse-150 细胞稀释至5×105/mL，将100 μL 悬浮液添加到Transwell 上室，涂以用无血清培养基1∶4 稀释后的Matrigel。在下室中，向24 孔板中加入600 μL含有15%胎牛血清、10 nmol/L 或20 nmol/L 姜黄素的RPMI-1640 培养基。细胞在37 ℃、含5% CO2的培养箱中培养24 h，随后用甲醇在-20 ℃固定10 min。用棉签去除上室Matrigel 内侧的细胞。侵袭到膜下侧的细胞用0.1%结晶紫在室温染色20 min，在倒置显微镜下计数侵袭成功的细胞。Transwell 迁移实验中，Transwell 上室未涂覆Matrigel，其余步骤与侵袭实验相同。

2.5 RT-PCR 检测各组细胞mRNA 表达 用10、20 nmol/L的姜黄素处理Kyse-150 细胞24 h，采用TRIzol 法提取各组细胞总RNA，每个样品离心后，取1 μL RNA 进行cDNA合成。每个cDNA 样本加入3 个复孔，整个过程按照RTPCR 试剂盒说明书操作。引物序 列： β-actin 正向5′-TGTTTGAGACCTTCAACACCC-3′，反向5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAGG-3′；Akt 正向5′-GCAGGATGTGGACCAACGTGAG-3′，反向5′-GCAGGCAGCGGATGATGAAGG-3′；mTOR正向5′-GAGATACGCTGTCATCCCTTTA-3′，反向 5′-CTGTATTATTGACGGCATGCTC -3′；MMP-2 正向5′-CACCTACACCAAGAACTTCCGTCTG-3′，反向 5′-GTGCCAAGGTCAATGTCAGGAGAG-3′；MMP-9 正向5′-TCCTGGTGCTCCTGGTGCTG-3′，反向5′-CTGCCTGTCGGTGAGATTGGTTC-3′。PCR 扩增条件为95 ℃预变性，10 min；变性95 ℃，15 秒；退火/延伸60 ℃，1 min，共40 个循环。

2.6 Western blot 检测各组细胞中蛋白表达 用10、20 nmol/L的姜黄素处理培养在100 mm 培养皿中的Kyse-150 细胞，24 h 后收获细胞并用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液裂解细胞。使用BCA 试剂盒测量蛋白质含量。煮沸变性后，等量的蛋白样品（30 μg）用4%～10% SDSPAGE 电泳分离，随后转移到PVDF 膜上，用5%脱脂牛奶在室温下封闭膜2 h，用一抗4 ℃孵育过夜，然后与二抗（1：10 000）在室温下孵育1 h。使用凝胶成像系统检测目标蛋白，通过Image J 软件分析印迹灰度，从而对目的蛋白进行半定量，以β-actin 作为内参。

2.7 统计学分析 使用SPSS 13.0 软件进行统计分析，数据以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析。 P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 姜黄素对食管癌Kyse-150 细胞增殖的抑制作用 图1显示，10～160 nmol/L 姜黄素可抑制Kyse-150 细胞的增殖，且随着药物浓度的增加越明显。姜黄素在Kyse-150 细胞中24、48 h 的半数抑制浓度分别为59.55、41.51 nmol/L，为避免高细胞毒性对细胞侵袭、转移能力的影响，选择10、20 nmol/L 进行实验。

图1 姜黄素对食管癌Kyse-150 细胞增殖的抑制作用（n=3）

3.2 姜黄素对食管癌Kyse-150 细胞迁移的抑制作用 划痕愈合实验结果显示，姜黄素的处理在一定程度上减慢了细胞平面迁移的速度和能力，对照组的伤口在24 h 时几乎完全融合，而姜黄素处理组的伤口在48 h 仍未愈合，划痕愈合率降低（P＜0.01）（图2）。另外，与对照组相比，10、20 nmol/L 姜黄素组细胞迁移成功细胞减少（P＜0.01）（图3A）。以上结果表明，经姜黄素处理后Kyse-150 细胞的迁移能力减弱。

图2 姜黄素对Kyse-150 细胞平面迁移的抑制作用（×40，n=3）

3.3 姜黄素对食管癌Kyse-150 细胞侵袭的抑制作用 与对照组相比，10、20 nmol/L 的姜黄素组细胞侵袭成功细胞减少（P＜0.01）（图3B），表明姜黄素可以抑制Kyse-150细胞的侵袭能力。

图3 姜黄素对Kyse-150 细胞迁移和侵袭的抑制作用（×200，n=3）

3.4 姜黄素对食管癌Kyse-150 细胞中侵袭转移相关蛋白mRNA 表达的抑制作用 如表1 所示，姜黄素10 nmol/L 组MMP-2、MMP-9 mRNA 表达低于DMSO 对照组（P＜0.01）；姜黄素20 nmol/L 组MMP-2、MMP-9 mRNA 表达也低于DMSO 对照组（P＜0.01）。然而，无论是姜黄素10 nmol/L还是20 nmol/L，Akt 和mTOR mRNA 表达均无变化。

表1 姜黄素对Kyse-150 细胞中Akt、 mTOR、 MMP-2、 MMP-9 mRNA 表达的影响（，n=3）

表1 姜黄素对Kyse-150 细胞中Akt、 mTOR、 MMP-2、 MMP-9 mRNA 表达的影响（，n=3）

注：与DMSO 组比较，**P＜0.01。

3.5 姜黄素下调食管癌Kyse-150 细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达 如图4 所示，姜黄素使Kyse-150 细胞中Akt、mTOR 的磷酸化水平降低（P＜0.05），尤其是20 nmol/L 组蛋白磷酸化水平下降（P＜0.01），但总的Akt、mTOR 的表达水平无变化。此外，侵袭转移相关蛋白MMP2 和MMP-9 的表达在药物治疗后也下调（P＜0.01）。以上结果表明，姜黄素可抑制PI3K/Akt/mTOR 信号通路。

图4 姜黄素对Kyse-150 细胞中蛋白相对表达的影响（，n=3）

4 讨论

到目前为止，化疗是治疗转移性或复发性癌症不可或缺的选择。姜黄素是姜黄属植物主要的活性成分，它在多种癌细胞中显示出强大的抗增殖活性［5-7]，本研究旨在证明姜黄素具有抗食管癌活性。先前的研究表明，姜黄素可以抑制肝癌、乳腺癌、肺癌和淋巴瘤等多种实体瘤的增殖、侵袭和迁移［8]，本研究首次证实姜黄素对人Kyse-150 食管癌细胞具有明显的细胞毒性，且呈剂量依赖性。此外，本研究使用不同转移细胞模型观察姜黄素对细胞侵袭和迁移的影响，发现姜黄素可以显著抑制Kyse-150 细胞的迁移和侵袭能力。

在肿瘤转移过程中，细胞外基质降解是一个重要的步骤。MMPs 是一个具有多方面作用的内肽酶家族，最著名的是它们降解细胞外基质成分的能力。它们在肿瘤细胞侵袭中起关键作用，并参与肿瘤转移的许多步骤。众所周知，MMP-2 和MMP-9 的上调与食管癌的侵袭转移有关。已有研究表明，姜黄素可以通过减弱上皮-间质转化、减少血管生成和阻止MMPs 降解细胞外基质等多种机制抑制肿瘤的迁移和侵袭［9]。在本研究中，实时荧光定量PCR 和Western blot 实验结果表明，在姜黄素处理后的Kyse-150 细胞中MMP-2 和MMP-9 基因转录和蛋白表达水平均下调。这一结果与已经报道的关于姜黄素抗癌机制的研究相似，提示姜黄素可以抑制人食管癌细胞的侵袭和转移，且这一现象与MMP-2 和MMP-9 的表达减少有关。

接下来，本研究进一步探讨姜黄素下调MMPs 的可能机制。研究表明，PI3K/Akt/mTOR 信号通路的过度表达参与了食管鳞状细胞癌的进展［10]。先前的研究表明，姜黄素可以抑制PI3K/Akt 及其下游靶标mTOR 的磷酸化［11-12]。PI3K/Akt/mTOR 信号通路保持细胞内稳态的平衡，并在调节各种癌细胞的生长、迁移和凋亡中发挥重要作用［13]，而mTOR［14]则作为细胞增殖、生长和存活的重要调节因子发挥作用，其过度表达被证明是一种独立的不良预后因素［8]。有研究证实PI3K/Akt/mTOR 过度活化后影响下游多种效应分子MMP-2 和MMP-9 的表达，在癌细胞内发挥促进增殖、迁移侵袭等关键作用［15]。因此，本研究关注这一途径，发现经姜黄素处理后，随着食管癌细胞侵袭和迁移能力的下降，MMP-2 和MMP-9 的表达也随之减少，而AKT 和mTOR 磷酸化水平降低，但AKT 和mTOR 的基因转录和总蛋白改变不大。基于这些结果，本研究认为姜黄素可以通过抑制PI3K/Akt/mTOR 通路的磷酸化，进而下调MMP-2 和MMP-9 的表达。

综上所述，本研究证实姜黄素通过抑制PI3K/Akt/mTOR 通路下调MMP-2 和MMP-9 的表达，从而抑制食管癌细胞侵袭和迁移。姜黄素可能是一种潜在的抗食管癌转移的药物。

致谢：本实验在海南医学院中医方药实验室完成，感谢课题组老师和师兄师姐的指导。