朱 琪，李庚喜，曾 立，伍世清

（邵阳学院药学院，湖南 邵阳 422000）

非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的特征是在没有饮酒史的前提下，肝脏脂肪变性，许多研究显示肥胖会显著增加NAFLD 的发生率［1]。随着生活节奏的加快和饮食习惯的改变，肥胖症等慢性病患者迅速增加，这引发了全球公共卫生工作者对现代社会健康问题的关注［2]。此外，NAFLD 和肥胖是许多代谢疾病的重要诱发因素，例如2 型糖尿病、心血管疾病、非酒精性脂肪肝炎、肝硬化和癌症，因此，寻找一种安全和有效的治疗方法已成为公共卫生目标［3]。

玉竹具有养阴润燥、生津止渴的功效［4]，玉竹多糖是其主要功效成分之一，由D-果糖、D-甘露糖、D-葡萄糖及半乳糖醛酸组成［5]。已有研究报道，玉竹多糖具有抗氧化、抗糖尿病和增强免疫活性等功能［6-8]，但关于它对改善肥胖以及非酒精性脂肪肝症状的机制研究报道不多。本研究通过建立高脂饮食诱导的肥胖模型大鼠，从体质量、血脂参数、肝功能酶、肝脏氧化应激、炎症因子和肝脏病理研究等多角度出发，探究玉竹多糖改善高脂饮食诱导的大鼠肥胖症状和预防NAFLD，以期为开发相关功能产品提供参考。

1 材料

1.1 动物 SPF 级雄性SD 大鼠40 只，体质量145～160 g，来自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号SCXK（湘）2016-0002，分笼饲养，自由饮水进食。高脂饮食参照《保健食品检验与评价技术规范-辅助降血脂功能评价方法》（2012 年修订），配方为基础饮食63.6%、蔗糖20.0%、猪油15.0%、胆固醇1.2%、胆酸钠0.2%。

1.2 药物与试剂 玉竹多糖购自于兰州沃特莱斯科技有限公司（批号WTLS-010），纯度≥30%，再采用水提醇沉法，经Sevag 分离纯化制得［9]，采用苯酚硫酸法测得样品中总糖质量分数约58%。甘油三酯（Triglyceride，TG，批号20180324）、总胆固醇（Total cholesterol，TC，批 号20180412）、高密度脂蛋白胆固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C，批号20180323）、低密度脂蛋白胆固醇（Density lipoprotein cholesterol，LDL-C，批号20180330）、丙氨酸氨基转移酶（Alanine aminotransferase，ALT，批号20180403）、天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate transaminase，AST，批号20180403）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD，批号20180415）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA，批号20180420）、抗过氧化物酶（Catalase，CAT，批号20180420）和谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px，批号20180416）等试剂盒购自南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor，TNF-α，货号EK0526）和白细胞介素-6（（Interleukin 6，IL-6，货号EK0412）等ELISA 试剂盒购自于武汉博士德生物工程公司；总RNA 提取试剂盒（货号9767）、逆转录试剂盒（货号RR047A）、RT-PCR 试剂盒（货号RR820A）购于日本TakaRa 公司；引物购于广州擎科生物技术有限公司；BCA 蛋白定量试剂盒（货号P0009）购于上海碧云天生物技术公司；p-p65 蛋白抗体（货号8242S）购于美国CST 公司；二抗（货号ab20272）购于英国Abcam 公司；ECL 发光剂（货号29050）购于北京英格恩生物有限公司。

1.3 仪器 多功能酶标仪（美国赛默飞世尔科技公司）；MIKRO22R 型台式冷冻离心机（德国Hettich 公司）；电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；冷冻干燥机（广州三元科技有限公司）；PowerGen 125 高速匀浆机（中国赛默飞世尔科技公司）；7060 全自动生化分析检测仪（日本Hitachi 公司）；移液枪（美国Thermo 公司）；病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；FluorChem FC2 化学发光凝胶成像系统（南京非同科学仪器有限公司）；Applied Biosystems 实时荧光定量PCR 仪器（美国赛默飞世尔科技公司）。

2 方法

2.1 大鼠肥胖模型建立 将40 只大鼠适应性饲养7 d，正常组8 只和高脂饮食组32 只。正常组正常饮食，高脂饮食组喂食高脂饮食。喂养4 周后，从高脂饮食组中选择24 只肥胖大鼠进一步灌胃玉竹多糖。肥胖模型大鼠的标准是高脂饮食组大鼠体质量比正常组平均体质量至少多20%。

2.2 分组、给药 正常组中的8 只大鼠通过管饲法用蒸馏水进行处理，32 只肥胖大鼠喂食高脂饮食分别为模型组，玉竹多糖低剂量组（200 mg/kg）、玉竹多糖中剂量（400 mg/kg）、玉竹多糖高剂量组（600 mg/kg）。正常组喂食普通饮食，其余4 组喂食高脂饮食。各组大鼠每日灌胃1 次，持续给药6 周。在实验结束前禁食12 h，所有大鼠用戊巴比妥钠麻醉后立即从腹主动脉抽取血液，分离血清离心，解剖收集肝脏、肾周脂肪，-80 ℃冰箱保存备用。

2.3 检测指标

2.3.1 体质量、肾周脂肪质量 大鼠体质量每7 d 称重1次，处死后解剖得到肾周白色脂肪组织，并称重记录。

2.3.2 血清脂质水平 将收集的血液静置45 min 后，3 000×g 离心15 min 分离血清。血清TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平按照试剂盒说明方法检测。

2.3.3 肝功能指标 按照试剂盒说明书方法，采用自动生化分析仪测量血清中ALT 和AST 的水平。

2.3.4 肝脏氧化指标 按照肝脏∶生理盐水（1 g∶9 mL）制备肝脏组织匀浆液，离心之后取上清液，按照试剂盒说明书方法，测定SOD、CAT、GSH-Px、MDA 水平。

2.3.5 组织病理学分析 大鼠肝脏病理切片制备。随机取3 只大鼠肝脏同一部位，4%多聚甲醛固定液固定。标本石蜡包埋，将切片置于油红O 染液中10 min，用自来水冲洗30 min，甘油封片。将制备好的切片放在100×光学显微镜下摄像并观察染色情况，评价其脂质积累程度。

2.3.6 肝脏炎症因子TNF-α 和IL-6 mRNA 表达 提取肝脏组织的总RNA，将RNA 反转录成cDNA，qRT-PCR 检测炎症因子TNF-α 和IL-6 mRNA 基因表达。引物序列见表1。

表1 引物序列

2.3.7 肝脏炎症因子TNF-α 和IL-6 释放及p-p65 蛋白表达按照ELISA 试剂盒提供的说明方法，采用酶标仪测量肝组织TNF-α 和IL-6 释放量。将收集的肝脏组织提取总蛋白，并将配制好的一抗（1∶1 000）和二抗（1∶10 000）进行免疫印迹，以GAPDH 作为内参。显影后，计算光密度值。

2.4 统计学分析 以GraphPad Prism 7 软件进行统计分析，数据采用（）表示，组间比较采用t 检验和单因素方差分析。 P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 不同剂量的玉竹多糖对肥胖大鼠体质量及肾周脂肪的影响 通常肥胖产生的过程中往往伴随着白色脂肪的增多，具体表现为白色脂肪质量增加［10]，而肾周脂肪组织是典型的白色脂肪组织，大鼠体质量变化结合肾周脂肪重量的变化更能有效判断肥胖。由图1 可知，与正常组相比，高脂饮食大鼠的体质量和肾周脂肪质量均提高（P＜0.01），与模型组相比，中剂量玉竹多糖组可降低体质量（P＜0.05），高剂量玉竹多糖组降低体质量（P＜0.01），低、中、高剂量玉竹多糖组均降低肾周脂肪质量（P＜0.01）。

图1 玉竹多糖对大鼠体质量及肾周脂肪质量的影响（，n=8）

3.2 不同剂量的玉竹多糖对大鼠血脂生化指标的影响 由图2 可知，与正常组比较，模型组大鼠血清TC、TG 和LDL-C 水平增高（P＜0.01），HDL-C 水平下降（P＜0.01），表明造模成功；与模型组比较，低、高剂量玉竹多糖组大鼠血清TC 水平降低（P＜0.01），低、中、高剂量玉竹多糖组大鼠血清TG 水平降低（P＜0.01），高剂量玉竹多糖组大鼠血清LDL-C 水平下降（P＜0.05），HDL-C 水平上升（P＜0.05）。

图2 玉竹多糖对大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C 水平的影响（，n=8）

3.3 不同剂量的玉竹多糖对大鼠肝功能酶的影响 由表2 可知，模型组大鼠的ALT 和AST 水平高于正常组（P＜0.01），说明高脂饮食组大鼠发生肝功能损伤；在玉竹多糖的干预下，肥胖大鼠的ALT 和AST 水平均低于模型组（P＜0.01）。

表2 玉竹多糖对大鼠AST 和ALT 水平的影响（，n=8）

表2 玉竹多糖对大鼠AST 和ALT 水平的影响（，n=8）

注：与正常组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01。

3.4 不同剂量的玉竹多糖对大鼠肝脏抗氧化酶活性（SOD、CAT 和GSH-Px）和过氧化产物MDA 水平的影响 如图3 所示，与正常组比较，模型组MDA 水平升高，抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）水平降低（P＜0.01）；经玉竹多糖处理后，高剂量组MDA 水平降低（P＜0.05），低、中、高剂量组均能提高抗氧化酶水平（P＜0.05，P＜0.01）。

图3 玉竹多糖对大鼠肝脏抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px）活性和过氧化产物（MDA）水平的影响（，n=8）

3.5 不同剂量玉竹多糖对大鼠肝脏脂质积累的影响 由图4 可知，正常组大鼠肝脏切片未发现明显脂滴；与正常组比较，模型组大鼠肝脏切片出现明显脂肪变性，脂滴增加明显。随着玉竹多糖干预剂量的增加，脂滴明显减少，其中高剂量玉竹多糖的脂滴减少更明显，这进一步表明玉竹多糖能够改善高脂饮食诱导的大鼠肝脏脂质积累。

图4 玉竹多糖对大鼠肝脏脂质积累的影响（×100）

3.6 不同剂量的玉竹多糖对大鼠肝脏中TNF-α 和IL-6 mRNA 表达的影响 由图5 可知，模型组较正常组肝脏中炎症因子TNF-α 和IL-6 mRNA 表达增加（P＜0.01）；玉竹多糖干预后，上述炎症因子mRNA 表达均有不同程度的降低，呈剂量依赖型，表明玉竹多糖能够下调肥胖大鼠肝脏组织的炎症因子TNF-α 和IL-6 mRNA 的表达。

图5 玉竹多糖对大鼠肝脏中炎症因子TNF-α、IL-6 mRNA 表达的影响（，n=8）

3.7 不同剂量的玉竹多糖对大鼠肝脏中TNF-α、IL-6 以及p-p65 蛋白表达的影响 如图6 所示，与正常组相比，模型组大鼠肝脏中TNF-α、IL-6 及p-p65 蛋白表达增加（P ＜0.01）；玉竹多糖处理后，TNF-α、IL-6 及p-p65 蛋白表达降低（P＜0.05，P＜0.01），且随着其剂量增加，p-p65 的蛋白表达逐渐降低，可能与下调NF-κB 信号通路、抑制促炎因子TNF-α 和IL-6 的蛋白和mRNA 表达有关。

图6 玉竹多糖对大鼠肝脏中炎症因子TNF-α、IL-6、p-p65 蛋白表达的影响（，n=8）

4 讨论

流行病学的研究表明，NAFLD 是全球最常见的慢性肝病［11]。随着国民物质生活水平的提高，我国的肥胖患者数量迅速增加，肥胖所引起的NAFLD 的发病率呈快速增长趋势［12]。血脂（包括甘油三酯与高、低密度脂蛋白）异常是肥胖患者常见的代谢标志之一［13]，血脂水平能够反映全身性的脂质代谢状态［14]。如今，高热量饮食习惯的流行，饮食中摄入的脂肪增加，体内的游离脂肪酸增多，积聚的甘油三酯也逐渐增多，一旦超过了肝脏存储的极限，将会产生有毒的脂质代谢物，这些代谢物又会导致肝损伤或肝功能障碍［15]，因此本试验中检测血脂TC、TG、LDL-C 和HDL-C 和大鼠肝脏切片油红O 染色来探究肥胖大鼠中脂肪聚集程度和NAFLD 损伤程度。在高脂饮食诱导的肥胖大鼠的过程中，由于肝脏积累了甘油三酯和游离脂肪酸，会产生过多的活性氧（ROS），体内的自由基代谢平衡主要是通过抗氧化系统维持，主要包括SOD、GSH-Px 和CAT 等［16]。MDA 是脂质过氧化物降解的主要产物，不仅能够阻止线粒体的呼吸链电子传递，还能促进炎症反应，因此促进肝脏内抗氧化酶活性（SOD、CAT 和GSH-Px）和抑制过氧化产物MDA 含量可以促进脂质代谢，预防肥胖所致NAFLD［17]。许多流行病学研究表明，肥胖与肝损伤风险增加有关［18]。肥胖使肝细胞易于发生脂质过氧化的同时，还会炎症变性，从而增加NAFLD、肝纤维化、肝硬化甚至肝细胞癌的可能性［19]。AST 和ALT 是肝脏代谢和转运功能的常见指标，一旦肝功能受损，其血清水平可显著升高［20]。世界卫生组织（WHO）把ALT 作为肝功能损伤最灵敏的测定指标［21]，因为1% 的肝细胞发生坏死时，血清中ALT 含量就会上升1倍［22]。已有研究表明，脂肪组织与炎症细胞之间存在密切关系［18]。肥胖往往会引起慢性炎症，可进一步造成全身性的炎症状态，造成代谢障碍，从而加快肥胖的进程［23]。“攻击性”炎性细胞因子（如TNF-α、IL-6 等）的无序生成通常与代谢综合征的发病机制密切相关，而NF-κB 是机体内调控促炎细胞因子（TNF-α、IL-6 等）的转录与合成的关键调控因子［24]。所以，通过NF-κB 信号通路调节机体免疫炎性反应，可以积极改善肥胖所致NAFLD［19，24]。

本研究显示，与正常组相比，模型组出现了许多与肥胖相关症状，包括NAFLD、高脂血症、肝功能损伤、氧化还原状态失衡和炎症。玉竹多糖处理组在减轻体重，血脂，氧化应激和脂肪源性和炎性细胞因子方面发挥了重要作用。在玉竹多糖干预下，肥胖大鼠的体重和肾周脂肪质量均有不同程度的降低，其中高剂量组的玉竹多糖效果最好（P＜0.05）；肥胖大鼠的血清中TC、TG 和LDL-C 的水平减少，而HDL-C 水平增多，尤其是高剂量组效果明显（P＜0.05）；低、中和高剂量的玉竹多糖均极显著降低了高脂饮食诱导的肥胖大鼠的血清ALT 和AST 水平（P＜0.01）；结合大鼠肝脏组织切片的油红O 染色发现，高脂饮食组脂滴明显高于正常组，并且随着玉竹多糖浓度的增加，其脂滴数量明显减少，肥胖大鼠肝脏脂质积累现象得到显著改善；不同剂量的玉竹多糖不仅能够提升抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）水平，降低机体内的MDA 水平，且呈剂量效应；玉竹多糖下调了肥胖大鼠肝脏组织的炎症因子TNF-α 和IL-6 mRNA 的表达，降低TNF-α 和IL-6 的释放量和p-p65 的蛋白表达。其中，中浓度和高浓度玉竹多糖抑制p65 的磷酸化的效果越来越好。玉竹多糖抑制TNF-α 和IL-6 的释放的机制可能与抑制NF-κB（p65）磷酸化，下调促炎因子TNF-α 和IL-6 mRNA 和蛋白表达有关。

综上所述，玉竹多糖可有效改善肥胖大鼠的肥胖和NAFLD，其机制可能与调节机体免疫反应，维持脂质正常代谢，减轻肝脏组织炎症反应，增强肝功能和降低脂质过氧化水平带来的毒性反应有关（图7）。在本实验浓度范围内，其处理效果与浓度呈正相关，高剂量组（600 mg/kg）玉竹多糖对肥胖大鼠的治疗作用相对最佳。我们的实验为揭示玉竹多糖减肥和预防NAFLD 疾病作用提供了科学数据。但机体内信号通路错综复杂［25]，玉竹多糖可有效改善肥胖大鼠的肥胖和NAFLD 的分子作用机制可能不是唯一，今后可以结合基因组学和蛋白组学等分子生物学技术做进一步的深入研究。

图7 玉竹多糖对高脂饮食诱导的肥胖大鼠的减肥和预防NAFLD 作用可能的机制