梅紫薇，徐艳艳，田伟强*，石森林，黎启帆，吴查青

（1.丽水市中心医院，浙江 丽水 323000；2.浙江中医药大学，浙江 杭州 310053；3.丽水市食品药品与质量技术检验检测院，浙江 丽水 323000）

黄连为毛茛科黄连Coptis chinensis Franch、三角叶黄连C.deltoidea C.Y Cheng et Hsiao 或云连C.teeta Wall.的干燥根茎，功效清热燥湿、泻火解毒等［1]，主要成分为生物碱［2]，其中小檗碱、巴马汀碱、黄连碱、表小檗碱、药根碱具有较强的药理活性［3-4]。研究表明，黄连总生物碱对应激所致的胃黏膜损伤具有保护作用；抑制肉芽组织增长，减弱特异性免疫功能［5-6]；抑制幽门螺旋杆菌和胃酸分泌，防止其附着于胃壁，预防胃溃疡的形成；明显降低胃蛋白酶活性，减少其对胃黏膜的侵害，从而保护胃黏膜［7-8]。课题组前期研究了黄连总生物碱在家兔体内的药动学特征，发现其t1/2短，口服生物利用度差［9]，故再将其制成胃内漂浮型缓释片，使其黏附于胃黏膜，延长作用时间，增加药物吸收［10-11]。

稳定性是制剂在保存过程中重要的考察指标之一，对其制备与质量评价具有重要作用，而溶解性、表观油水分配系数是考察药物理化性质重要的参数。为了将黄连总生物碱制成安全有效、质量可控的胃内漂浮型缓释片，本实验考察其稳定性、溶解性、表观油水分配系数，以期为相关制剂工艺的研究提供依据。

1 材料

1.1 试剂与药物 黄连总生物碱（自制，批号20190822）。盐酸小檗碱（批号M24A10K86772）、盐酸黄连碱（批号 Z22A10X94861）、药根碱（批号Z11M8S35794）、盐酸巴马汀（批号Z16J10X79792）、表小檗碱（批号F26O10X95974）对照品（上海源叶生物科技有限公司）。胰酶（批号A25N10L103650）、胃蛋白酶（批号L05N10J102095）（上海源叶生物科技有限公司）。磷酸二氢钾（批号20180308）、乙酸乙酯为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；十二烷基硫酸钠为分析纯（天津市大茂化学试剂厂）；磷酸、乙醇为分析纯（成都市科隆化学品有限公司）；甲醇、正辛醇为分析纯（上海麦克林生化科技有限公司）；甲醇、乙腈为色谱纯（默克股份两合公司）；水为超纯水。

1.2 仪器 XS105DU 电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；TU-1901 紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；Milli-Advantagea A10 超纯水系统［默克化工技术（上海）有限公司]；Agilent 1200 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；KQ-300DB 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；酸度计［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；LABOPORT 真空泵N816（德国KNF 公司）；振荡器（上海一恒科学仪器有限公司）

2 方法与结果

2.1 黄连总生物碱含量测定

2.1.1 溶液制备

2.1.1.1 对照品溶液 精密称取盐酸小檗碱对照品1.6 mg，甲醇超声溶解并定容至50 mL，摇匀，即得。

2.1.1.2 供试品溶液 精密称取黄连总生物碱提取物8.5 mg，甲醇超声溶解并定容至100 mL，摇匀，再精密量取0.95 mL，甲醇稀释至10 mL，摇匀，即得。

2.1.2 检测波长确定 吸取对照品、供试品溶液适量，置于紫外分光光度计中，在200～400 nm 波长范围内进行光谱扫描。结果显示，2 种溶液均在345 nm 波长处有最大吸收，故选择其作为检测波长。

2.1.3 线性关系考察 精密量取对照品溶液1.0、1.2、1.3、1.5、1.8、2.0 mL，分别用甲醇稀释并定容至10 mL，置于紫外分光光度计中，在345 nm 波长处测定吸光度。以对照品质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（A）进行回归，得方程为A=0.067 6X-0.000 3（r=0.999 9），在3.2～6.4 μg/mL 范围内呈良好的线性关系。

2.1.4 精密度试验 取对照品溶液，按“2.1.3”项下方法测定6 次吸光度，测得其RSD 为0.035%，表明仪器精密度良好。

2.1.5 重复性试验 取提取物6 份，按“2.1.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.3”项下方法测定吸光度，测得黄连总生物碱含量RSD 为0.08%，表明该方法重复性较好。

2.1.6 稳定性试验 取同一份提取物，按“2.1.1.2”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 按“2.1.3”项下方法测定吸光度，测得其RSD 为1.83%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.1.7 加样回收试验 称取9 份黄连总生物碱含量已知的提取物，分成3 组，分别加入80%、100%、120%水平的对照品，甲醇超声溶解并定容至100 mL，精密量取1 mL，甲醇溶解定容至10 mL，摇匀，按“2.1.3”项下方法测定吸光度，计算回收率。结果，黄连总生物碱平均加样回收率为99.07%，RSD 为0.99%。

2.2 5 种生物碱含量测定

2.2.1 溶液制备

2.2.1.1 对照品溶液 精密称取对照品盐酸小檗碱1.1 mg、盐酸黄连碱1.4 mg、药根碱0.8 mg、盐酸巴马汀1.9 mg、表小檗碱0.9 mg，置于同一量瓶中，甲醇超声溶解并定容至25 mL，摇匀，即得（盐酸小檗碱44 μg/mL、盐酸黄连碱56 μg/mL、药根碱32 μg/mL、盐酸巴马汀76 μg/mL、表小檗碱36 μg/mL）。

2.2.1.2 供试品溶液 精密称取黄连总生物碱提取物1.1 mg，甲醇溶解并定容至10 mL，摇匀，即得。

2.2.2 色谱条件 ZORBAX SB-C18色谱柱；流动相乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾（38∶62），每100 mL 加入十二烷基硫酸钠0.4 g（磷酸调pH 至4.0）；体积流量1.0 mL/min；柱温40 ℃；检测波长345 nm；进样量10 μL。

2.2.3 系统适用性试验与专属性考察 取对照品、供试品溶液，在“2.2.2”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，5 种生物碱色谱峰峰形良好，均能达到基线分离（分离度均大于1.5），对称因子均在0.92～1.05 之间，理论塔板数均大于10 000，甲醇不干扰测定。

图1 各生物碱HPLC 色谱图

2.2.4 线性关系考察 精密量取对照品溶液0.5、1、2、3、4、5 mL，甲醇稀释并定容 至10 mL，摇匀，在“2.2.2”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得方程分别为盐酸小檗碱Y=35.784X-7.094 5（r=0.999 9），在2.2～22 μg/mL 范围内线性关系良好；盐酸黄连碱Y=30.382X-9.167 2（r=0.999 8），在3.0～30 μg/mL 范围内线性关系良好；药根碱Y=32.552X-3.265（r=0.999 9），在1.6～16 μg/mL 范围内线性关系良好；盐酸巴马汀Y=8.492 1X-5.123 4（r=0.999 5），在3.8～38 μg/mL 范围内线性关系良好；表小檗碱Y=39.595X-8.089 6（r=0.999 8），在1.8～18 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度试验 取对照品溶液，在“2.2.2”项色谱条件下进样测定6 次，测得各生物碱峰面积RSD 分别为盐酸小檗碱0.872%、盐酸黄连碱0.830%、药根碱0.909%、盐酸巴马汀0.974%、表小檗碱0.977%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取同一份提取物，按“2.2.1.2”项下制备供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.2.2”项色谱条件下进样测定，测得各生物碱峰面积RSD 分别为盐酸小檗碱0.80%、盐酸黄连碱0.82%、药根碱2.10%、盐酸巴马汀0.49%、表小檗碱1.01%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.2.7 重复性试验 取6 份提取物，每份约为8.5 mg，精密称定，按“2.2.1.2”项下方法制备6 份供试品溶液，在“2.2.2”项色谱条件下进样测定，测得各生物碱含量RSD分别为盐酸小檗碱0.820%、盐酸黄连碱0.825%、药根碱2.506%、盐酸巴马汀0.611%、表小檗碱1.207%，表明该方法重复性较好。

2.2.8 加样回收试验 称取各生物碱含量已知的提取物9份，分成3 组，分别加入80%、100%、120% 水平的盐酸小檗碱、盐酸黄连碱、药根碱、盐酸巴马汀、表小檗碱，按“2.2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.2”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，盐酸小檗碱平均加样回收率为98.91%，RSD 为0.68%；盐酸黄连碱平均加样回收率为98.53%，RSD 为0.53%；药根碱平均加样回收率为98.89%，RSD 为0.41%；盐酸巴马汀平均加样回收率为98.58%，RSD 为0.137%；表小檗碱平均加样回收率为98.89%，RSD 为0.41%。

2.3 稳定性研究

2.3.1 高湿试验 根据《原料药物与制剂稳定性试验指导原则》（以下简称《指导原则》），称取提取物适量，置于培养皿中，摊成≤5 mm 厚的薄层，分别敞口置于温度25 ℃、相对湿度92.5%（KNO3饱和溶液）及温度25 ℃、相对湿度75%（NaCl 饱和溶液）的密闭容器中，于放置后第0、5、10 天取样，准确称定实验前后供试品质量，结果见表1。由此可知，在2 种相对湿度条件下，提取物吸湿增重均＜5%。

表1 高湿试验结果（n=3）

2.3.2 高温试验 根据《指导原则》 称取提取物适量，置于培养皿中，摊成≤5 mm 厚的薄层，敞口置于60 ℃下，于放置后第0、5、10 天取样，测定含量，结果见表2。由此可知，在该温度下各成分含量无明显变化。

表2 高温试验结果（n=3）

2.3.3 强光照试验 根据《指导原则》 称取提取物适量，置于培养皿中，摊成≤5 mm 厚的薄层，室温下敞口置于4 500 lx光照强度下，于放置后第0、5、10 天取样，观察供试品外观，测定含量，结果见表3。由此可知，供试品外观、各成分含量均无明显变化。

表3 强光照试验结果（n=3）

2.4 溶解度测定 量取pH 2.3、3.5、4.2 的磷酸盐缓冲液，超纯水，0.1 mol/L HCl，甲醇，乙醇，乙酸乙酯，正辛醇各5 mL，加入过量提取物，置于恒温振荡器中，在（37±0.5）℃下120 r/min 振摇24 h 充分溶解，静置，微孔滤膜过滤，按“1.1.2”项下方法测定吸光度，计算溶解度，结果见表4。

表4 溶解度测定结果

2.5 表观油水分配系数测定 吸取适量正辛醇溶液，分别与同体积pH=2.6、pH=4.0、pH=6.8 磷酸盐溶液，超纯水，人工胃液，人工肠液混合后置于试管中，在（37±0.5）℃下120 r/min 振摇24 h，12 000 r/min 离心10 min，分别取上、下层，其中上层（油相）为水饱和正辛醇溶液，下层（水相）为正辛醇饱和水溶液。

精密吸取上层溶液（油相）至试管中，加入过量提取物，置于恒温振荡仪中，在（37±0.5）℃下120 r/min 振摇24 h，离心，取水层，0.45 μm 微孔滤膜过滤，按“1.1.2”项下方法测定吸光度，计算质量浓度C0；精密吸取上层溶液（油相）3 mL 至试管中，加入下层溶液（水相），置于恒温振荡器中，在（37±0.5）℃下120 r/min 振摇24 h，离心，取水层，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，按“1.1.2”项下方法测定吸光度，计算质量浓度Cw，再计算表观油水分配系数P，公式为P=（C0-Cw）/Cw，结果见表5。

表5 表观油水分配系数测定结果

3 讨论

本实验建立了黄连总生物碱UV、HPLC 含量测定方法，并进行了方法学考察，发现其准确度高；考察了该成分分别在高温、高湿、强光照条件下含量变化，发现均无明显变化，表明它在上述条件下性质稳定，再通过指标成分法研究该成分在不同介质中的溶解性［12]，发现pH 为2.3～4.2 时其溶解性呈下降趋势，在pH=2.3 磷酸盐缓冲液中溶解量最大，表明在酸性溶液中该成分溶解性较号。

油水分配系数可模拟药物在生物体内水相和生物相之间的分配情况，从而预测药物在肠道的吸收情况。大部分药物的溶解度参数为8～12，而正辛醇为10.24，接近细胞膜溶解度参数10.3，可使药物形成近似理想的溶液，具有更好的极性和溶解性，故选择该溶剂作为油相来模拟生物膜［13]。

表观油水分配系数P 的对数（lgP）在-1～2 范围内时，可认为药物在胃肠道吸收较好［14-16]。人体胃肠道pH值在1.4～8 之间，而本实验发现，黄连总生物碱在上述pH范围内的lgP 为-1～2，表明其渗透性较好，为药物最佳吸收范围，可被胃肠道吸收，而且在人工胃液中的渗透性优于其他溶液，可为相关剂型制备工艺开发提供参考。