黄 雯，洪 静，刘亚平，叶喜德*，彭玲珍*

（1.江西中医药大学，江西 南昌 330004；2.上海市奉贤区中心医院，上海 201400；3.江西中医药大学附属医院，江西 南昌 330004）

马兰草Kalimeris indica L.为菊科马兰属植物，全草可入药，在我国大部地区均有分布，尤其是在贵州，民间又名田边菊、路边菊、鸡儿肠、鱼鳅串等［1]，富含多种维生素、矿物质、氨基酸等，营养价值较高，具有清热利湿、理气消食、解毒消肿的功效，水煎剂可用于治疗胃脘胀痛、感冒咳嗽等疾病［2]，其成分包括三萜类鞣质类、酚酸类、黄酮类、甾体类等［3-5]，具有抗炎、抗氧化等作用［6-7]。目前，有部分中成药（如马兰感寒胶囊、感清糖浆等）以马兰草为原料生产，在2003 年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》 中其质量控制方法比较简单，无含量测定项，一定程度上限制了其应用推广。目前，相关报道大多数停留在单一成分或某一类成分的测定［8-12]，而多成分含量测定的盛行对控制药材及其相关产品起导向性作用［13-16]。因此，本实验建立UHPLC 法同时测定马兰草中10 种成分，以期为该药材质量控制及应用推广提供参考。

1 材料

LC-30AD 型高效液相色谱仪、AUW220D 型电子天平（十万分之一，日本岛津公司）；BS-224S型电子天平（万分之一，德国Sartorius 公司）；KQ250-DB 型数控超声波清洗器（巩义市予华仪器有限责任公司）；KQ-5200 型水浴锅（昆山市超声仪器有限公司）。

绿原酸（批号110753-201817，纯度96.8%）、木犀草苷（批号111720-201810，纯度93.5%）、木犀草素（批号111520-202006，纯度94.4%）对照品均购于中国食品药品检定研究院。新绿原酸（批号20180911，纯度98.7%）、隐绿原酸（批号20170611，纯度99.2%）、木犀草素-7-O-芸香糖苷（批号20171031，纯度98.6%）、异绿原酸A（批号20180921，纯度99.5%）、异绿原酸B（批号20181123，纯度99.8%）、异绿原酸 C（批号20180511，纯度99.5%）、大波斯菊苷（批号20180313，纯度98.5%）对照品均购于成都曼思特生物科技有限公司。甲醇、乙腈为色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。马兰草共24 批，由江西中医药大学中药鉴定教研室胡生福副教授鉴定为正品，具体信息见表1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 供试品溶液制备 取药材粉末（过4 号筛）1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25 mL 70%甲醇，称定质量，回流提取30 min，冷却，70% 甲醇补足减失的质量，滤过，滤液经0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2 对照品溶液制备 精密称取各对照品适量，加甲醇制备成每1 mL分别含新绿原酸0.013 8 mg、绿原酸0.091 2 mg、隐绿原酸0.018 0 mg、木犀草苷0.027 6 mg、木犀草素-7-O-芸香糖苷0.018 0 mg、异绿原酸B 0.028 8 mg、异绿原酸A 0.109 8 mg、大波斯菊苷0.027 6 mg、异绿原酸C 0.048 0 mg、木犀草素0.002 4 mg 的溶液，即得。

2.3 色谱条件 Welch-C18色谱柱（100 mm ×2.1 mm，1.7 μm）；流动相乙腈（A）-0.3% 冰醋酸（B），梯度洗脱（0～6 min，3%～15% A；6～13 min，15% A；13～15 min，15%～17% A；15～18 min，17%～18% A；18～22 min，18%～19% A；22～25 min，19%A；25～30 min，19%～29%A；30～35 min，29%～49% A；35～36 min，49%～80% A；36～38 min，80%A；38～39 min，80%～3%A；39～41 min，3%A；体积流量0.3 mL/min；柱温40 ℃；检测波长326 nm；进样量4 μL。色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 线性关系考察 精密吸取“2.2”项下对照品溶液，溶剂稀释至不同倍数后在“2.3”项条件下分析。以峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X）进行回归，结果见表2，表明各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度试验 取对照品溶液，在“2.3”项条件下进样6 次，测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、木犀草苷、木犀草素-7-O-芸香糖苷、异绿原酸B、异绿原酸A、大波斯菊苷、异绿原酸C、木犀草素峰面积RSD 分别为0.46%、1.01%、0.45%、1.20%、1.13%、0.76%、0.42%、1.50%、1.04%、1.42%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取样品（S12），按“2.1”项下方法制备供试品溶液，于室温0、2、4、8、12、24 h 在“2.3”项条件下进样，测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、木犀草苷、木犀草素-7-O-芸香糖苷、异绿原酸B、异绿原酸A、大波斯菊苷、异绿原酸C、木犀草素峰面积RSD 分别为0.32%、1.31%、0.29%、1.24%、1.17%、0.56%、1.82%、0.72%、1.48%、1.60%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验 取样品（S2），按“2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.3”项条件下进样，测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、木犀草苷、木犀草素-7-O-芸香糖苷、异绿原酸B、异绿原酸A、大波斯菊苷、异绿原酸C、木犀草素峰面积RSD 分别为1.43%、1.67%、1.42%、1.29%、1.01%、1.26%、1.04%、1.47%、1.62%、1.58%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的样品0.5 g，共6 份，按100% 水平加入各对照品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项条件下进样，计算回收率。结果，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、木犀草苷、木犀草素-7-O-芸香糖苷、异绿原酸B、异绿原酸A、大波斯菊苷、异绿原酸C、木犀草素回收率（RSD）分别为98.20%（1.61%）、99.20%（0.51%）、99.25%（2.13%）、99.71%（0.58%）、99.95%（0.77%）、99.65%（0.57%）、99.61%（0.41%）、100.35%（1.22%）、99.91%（0.53%）、101.00%（0.78%）。

2.9 样品含量测定 取24 批样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项条件下分析，计算含量，结果见表3。

表3 各成分含量测定结果（mg/g）Tab.3 Results of content determination of various constituents（mg/g）

3 讨论

本研究根据前期预实验发现，甾体类（如α-菠甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷）和生物碱类（如金色酰胺醇）成分，采用液相色谱方法进行定量发现，色谱峰未出现目标化合物，可能由于单一成分含量过低或者由于样品处理方法、流动相选择而导致无法检测。本研究采用UHPLC 法对马兰草多成分含量进行测定，该方法简单、准确性好。同时对不同来源的样品进行含量测定，在测定的10 种成分中，发现总酚酸的含量要高于总黄酮，且单成分异绿原酸A 的含量，在所有批次中平均含量最高，其次为绿原酸。马兰草是一种药食两用植物，具有抗炎抗氧化等作用，酚酸和黄酮类化合物往往都具有此功效，测定马兰草中酚酸和黄酮化合物的含量，以期对于日后评价量效关系，进一步拓展和推广马兰草的使用提供参考。