地黄多糖对东莨菪碱诱导小鼠学习记忆能力障碍的改善作用及其机制

2021-06-26马媛媛姚晓英谈卓臣廖茂行

中成药 2021年6期

马媛媛，姚晓英，谈卓臣，廖茂行

（上海市公共卫生临床中心，上海 201508）

学习记忆障碍是指近期记忆不能转入长时记忆及对以往储存的信息提取困难的症状，为中枢神经系统疾病［1]，随着人口的老龄化其发病比例不断增加，对老年人的影响日益严重。学习记忆障碍的发病机制复杂，现有的治疗药物主要包括抗氧化剂、自由基清除剂、脑代谢调节剂、减缓谷氨酸传递及改善胆碱能神经系统类药物，但效果难以让人满意［2]。中药及其复方制剂不良反应小，对疾病的多个途径、多个靶点均有干预作用，并对学习记忆障碍的治疗具有较大优势［3]。

地黄应用历史悠久，具有抗老年痴呆、治疗糖尿病、补血、滋阴等诸多药理作用，环烯醚萜苷类、糖类等是其主要活性成分［4]。研究发现，地黄中的寡糖成分可以改善痴呆大鼠的学习记忆能力，其机制与减少神经元凋亡、降低氧化应激水平及提高乙酰胆碱含量有关［5-6]，而多糖成分具有抗氧化、调节血糖和血脂、增强免疫功能、促进造血功能、抗肿瘤及促进间充质干细胞增殖等作用［7]。但目前尚未发现地黄多糖提高学习记忆能力方面的报道，故本实验拟研究该成分是否具有改善东莨菪碱诱导的小鼠学习记忆能力障碍作用，并初步探讨分子机制，为其进一步应用奠定基础。

1 材料

1.1 动物 SPF 级昆明种小鼠80 只，雄性，体质量18～22 g，由菲诺克生物科技（上海）有限公司提供，动物生产许可证号SCXK（沪）2018-0005。

1.2 试剂与药物地黄多糖为淡黄色粉末，经苯酚硫酸法测定总糖质量分数在90% 以上，由陕西慈缘生物技术有限公司提供（批号20190126）。多奈哌齐（陕西方舟制药有限公司，批号20190224）；氢溴酸东莨菪碱（上海晶纯生化科技股份有限公司）；乙酰胆碱转移酶（ChAT）、乙酰胆碱酯酶（AChE）活性检测试剂盒（批号20190518、20190615，泉州市九邦生物科技有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性及丙二醛（MDA）水平检测试剂盒（批号S0109、S0051、S0131M，上海碧云天生物技术有限公司）；肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）水平检测试剂盒（批号H052、H002，南京建成生物工程研究所）；兔源核因子κB p65（NF-κB p65）、NF-κB 抑制蛋白α（IκBα）及 β-肌动蛋白（β-actin）抗体（批号ab16502、ab7217、ab8227，英国Abcam 公司）；辣根酶标记的山羊抗兔IgG 二抗（批号C020208，洛阳佰奥通实验材料中心有限公司）。

1.3 仪器 ML104/02 型电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；Spectra Max M5 型多功能酶标仪（美国MD 公司）；低温高速多功能离心机（德国Eppendorf 公司）；小型垂直蛋白电泳仪（美国伯乐公司）。

2 方法

2.1 分组、给药与建模 80 只小鼠随机分为正常组、模型组、阳性药多奈哌齐组（3 mg/kg）及地黄多糖高（30 mg/kg）、低（15 mg/kg）剂量组，每组16 只，适应性饲养1 周后开始给药。正常组及模型组小鼠灌胃同体积的生理盐水，连续28 d。自第24 天开始，于灌胃给药结束30 min 后正常组小鼠腹腔注射生理盐水0.2 mL，其余各组均腹腔注射3 mg/kg 氢溴酸东莨菪碱，连续5 d。

2.2 Morris 水迷宫实验末次注射氢溴酸东莨菪碱后30 min，通过Morris 水迷宫实验开展学习能力和记忆能力测试。安全平台位于第Ⅲ象限中央，在Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ象限的中央处将小鼠放入水池，每次训练时间90 s，每天3 次，连续5 d。如果小鼠找到安全平台时间少于90 s，则记录实际寻找平台所需时间，即为逃避潜伏期；如果找到安全平台时间大于90 s，则需将其引致安全平台，逃避潜伏期记为90 s。空间探索实验在逃避潜伏期实验完成后开始，于第Ⅰ象限的中央处将小鼠放入水池，观察90 s 内在第Ⅲ象限路程百分比、第Ⅲ象限的停留时间、首次穿越平台时间、穿越平台次数。

2.3 海马组织神经递质、氧化应激及炎症指标检测 Morris 水迷宫实验完成后，各组随机取8 只小鼠，颈椎脱臼法处死，无菌操作分离脑组织，快速分离海马，加入预冷的生理盐水制备10% 组织匀浆液，12 000 r/min 离心10 min。用微量移液器枪头小心吸取上清液，在-80 ℃冰箱中保存备用。采用酶联免疫吸附法，参照试剂盒操作步骤检测海马组织 ChAT、AChE、SOD、CAT 活性及 MDA、TNF-α、IL-1β 水平。

2.4 蛋白免疫印迹实验 Morris 水迷宫实验后各组取剩余8 只小鼠，颈椎脱臼法处死，无菌操作分离脑组织，快速分离海马置于研钵中，缓慢加入液氮并研磨，再加入组织裂解液，裂解30 min 后12 000 r/min 离心10 min，微量移液器枪头小心吸取上清液，BCA 法检测蛋白表达。在70 V 恒压电泳下用10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，手术刀片切取目的条带，在300 mA 电流下将分离的蛋白转至聚氯乙烯膜上，常温下脱脂奶粉封闭1.5 h，漂洗后加入NF-κB p65、IκB-α 及β-actin 抗体，4 ℃孵育过夜，漂洗后再加入HRP标记的二抗，继续孵育1.5 h，化学发光法显色曝光，ImageJ 1.8.0 软件分析蛋白灰度值，计算NFκB p65 及IκB-α 蛋白相对表达量。

2.5 统计学分析通过SPSS 20.0 软件进行处理，结果以（）表示，组内比较采用one-way ANOVA检验，组间比较采用LSD 法。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 地黄多糖对各组小鼠学习能力障碍的影响模型组小鼠从第1 天到第5 天的逃避潜伏期与正常组比较均增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较，阳性药多奈哌齐组及地黄多糖高、低剂量组小鼠的逃避潜伏期均有一定程度的降低，其中阳性药多奈哌齐组及地黄多糖高剂量组从第1 天开始，地黄多糖低剂量组从第2 天开始差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），表明地黄多糖对东莨菪碱诱导的小鼠学习能力障碍具有改善作用。见表1。

表1 地黄多糖对各组小鼠学习能力障碍的影响（，n=16）Tab.1 Effects of RGLPs on learning impairment of mice in various group（，n=16）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 地黄多糖对各组小鼠记忆能力障碍的影响与正常组比较，模型组小鼠在第Ⅲ象限路程百分比、第Ⅲ象限停留时间及穿越平台次数降低，而首次穿越平台时间增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较，阳性药多奈哌齐组及地黄多糖高、低剂量组小鼠在第Ⅲ象限路程百分比、第Ⅲ象限停留时间及穿越平台次数增加（P＜0.01），而首次穿越平台时间降低（P＜0.01）。见表2。

表2 地黄多糖对各组小鼠记忆能力障碍的影响（，n=16）Tab.2 Effects of RGLPs on memory impairment of mice in various group（，n=16）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01。

3.3 地黄多糖对各组小鼠海马组织ChAT 和AChE活性的影响与正常组比较，模型组小鼠海马组织ChAT 活性减少（P ＜0.01），而AChE 活性增加（P＜0.01）；阳性药多奈哌齐组及地黄多糖高、低剂量组小鼠海马组织ChAT 活性增加，而AChE 活性减少，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表3。

表3 地黄多糖对各组小鼠海马组织ChAT、AChE 活性的影响（，n=8）Tab.3 Effects of RGLPs on ChAT and AChE activities in hippocampal tissues of mice in various groups（，n=8）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01。

3.4 地黄多糖对各组小鼠海马组织SOD、CAT 活性及MDA 水平的影响与正常组比较，模型组小鼠海马组织SOD、CAT 活性减少（P ＜0.01），而MDA 水平增加（P＜0.01）；阳性药多奈哌齐组及地黄多糖高、低剂量组小鼠海马组织SOD、CAT活性增加，而MDA 水平降低，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。见表4。

表4 地黄多糖对各组小鼠海马组织SOD、CAT 活性及MDA 水平的影响（，n=8）Tab.4 Effects of RGLPs on SOD，CAT activities and MDA level in hippocampal tissues of mice in various groups（，n=8）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.5 地黄多糖对各组小鼠海马组织TNF-α 及IL-1β 水平的影响模型组小鼠海马组织TNF-α 及IL-1β 水平与正常组比较升高（P＜0.01）；阳性药多奈哌齐组及地黄多糖高、低剂量组小鼠海马组织TNF-α 及IL-1β 水平降低，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表5。

表5 地黄多糖对各组小鼠海马组织TNF-α 及IL-1β 水平的影响（，n=8）Tab.5 Effects of RGLPs on TNF-α and IL-1β levels in hippocampal tissues of mice in various groups（，n=8）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01。

3.6 地黄多糖对各组小鼠海马组织NF-κB p65 及IκB-α 表达的影响模型组小鼠海马组织NF-κB p65 表达与正常组比较增加（P＜0.01），而IκB-α表达降低（P＜0.01）；阳性药多奈哌齐组及地黄多糖高、低剂量组小鼠海马组织NF-κB p65 表达降低，而IκB-α 表达增加，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图1、表6。

表6 地黄多糖对各组小鼠海马组织NF-κB p65 及IκB-α表达的影响（，n=8）Tab.6 Effects of RGLPs on NF-κB p65 and IκB-α expressions in hippocampal tissues of mice in various groups（，n=8）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01。

图1 各组小鼠海马组织NF-κB p65、IκB-α 表达Fig.1 NF-κB p65 and IκB-α expressions in hippocampal tissues of mice in various groups

4 讨论

在中枢神经系统中，几乎所有的脑区都受胆碱能神经系统支配，广泛分布于嗅结节、纹状体、基底前脑、中脑区、后脑、脊髓等，参与应激反应及学习记忆等重要生理过程［8]。ACh 是胆碱能系统的主要神经递质，作为与学习记忆最密切相关的神经递质，其水平高低决定着能力强弱［9]。ChAT 为ACh 的合成酶，可以催化胆碱与乙酰辅酶A 合成ACh；AChE 可以将ACh 分解为胆碱和乙酸，降低ACh 水平，ChAT 与AChE 的活性共同决定着其水平［10]。本实验发现，地黄多糖干预后东莨菪碱诱导的模型小鼠海马组织ChAT 活性增加，而AChE活性减少，表明调节胆碱能神经系统功能是地黄多糖改善模型小鼠学习记忆能力障碍的潜在原因。

神经组织结构独特，更容易遭受氧自由基的攻击，破坏DNA 等大分子结构，诱导神经细胞凋亡和死亡，导致学习记忆能力障碍［11]。研究发现，患者体内抗氧化能力下降、自由基堆积，是造成神经细胞毒性的重要原因，进而影响学习记忆功能［12]。SOD 是体内重要的抗氧化酶，在学习记忆能力障碍患者体内其活性下降，自由基大量产生，引起脑组织功能受损［13]。CAT 可降低H2O2的浓度，从而有效缓解学习记忆能力障碍的发生与进展［11]。MDA 可反映机体受自由基影响的程度，其本身也具有毒性，会导致学习记忆能力障碍患者神经元细胞变性、凋亡及坏死［14]。本实验发现，地黄多糖干预后东莨菪碱诱导的模型小鼠海马组织SOD、CAT 活性增加，而MDA 水平减少，表明抗氧化应激是地黄多糖改善模型小鼠学习记忆能力障碍的潜在机制。

炎症反应在东莨菪碱诱导的小鼠学习记忆障碍过程中占有重要地位，在学习记忆能力障碍患者体内TNF-α、IL-1β 水平升高［15]。研究发现［16]，益智护脑方可以通过降低昆明小鼠海马组织中的TNF-α 及IL-1β 水平，缓解东莨菪碱所致记忆功能障碍。右美托咪定保护东莨菪碱导致的老年大鼠认知功能障碍作用，也与减轻了炎症因子TNF-α、IL-1β 水平有关［17]；本研究发现，地黄多糖组小鼠海马组织TNF-α 及IL-1β 水平降低，表明抑制炎症反应与地黄多糖改善模型小鼠学习记忆能力障碍作用密切相关。NF-κB 广泛存在于体内所有细胞中，可调节神经细胞炎症因子表达及活化，参与炎症过程、神经元可塑性、机体免疫及学习记忆等多种生理、病理过程［18]，当机体受到外界刺激时被激活，促进下游炎症因子TNF-α 及IL-1β 水平的增加［19]。IκB-α 是NF-κB 的上游信号诱导物，为NF-κB 的重要抑制因子，其表达量增加有助于抑制炎症反应，缓解学习记忆能力障碍症状［20]。本研究发现，地黄多糖组小鼠海马组织NF-κB p65 表达降低，而IκB-α 表达增加，进一步表明地黄多糖可以下调NF-κB 信号通路的活化水平进而抑制炎症反应。

综上所述，地黄多糖可有效改善东莨菪碱诱导的小鼠学习记忆能力障碍，该作用与调节胆碱能神经系统功能、抗氧化应激及抑制炎症反应有关。