孟军华，安 靖，王 雄，陈永刚，张 宇，张恩景

［武汉市第三医院（武汉大学附属同仁医院） 药学部，湖北 武汉430060]

乳腺增生症多发生于30～50 岁女性，致病原因主要是内分泌功能紊乱，雌、孕激素比例失调，使乳腺实质增生过度和复旧不全［1]，中医称之为“乳癖”，临床辨证多分为肝郁气滞型、冲任失调型和痰瘀互结型［2]。回乳抑增一号是武汉市第三医院治疗乳腺增生的经验方，具有回乳消胀、软坚散结、行气活血之功效。前期药效学实验证实回乳抑增一号能显著缩小乳腺增生大鼠的乳房直径，调节各种性激素水平［3]；本研究通过观察回乳抑增一号对乳腺增生大鼠乳腺组织雌激素受体α（ERα）、孕激素受体（PR）、增殖细胞核抗原（PCNA），血管内皮生长因子（VEGF）、细胞凋亡相关调控因子Bcl-2、Bax 表达的影响，进一步探讨该方作用机理。

1 材料与方法

1.1 动物 选用健康清洁级雌性未孕SD 大鼠（SPF 级）56 只，体质量（200±20）g，购自湖北省实验动物研究中心，动物生产许可证号SCXK（鄂）2008-0005，于SPF 级动物房饲养，温度（25±1）℃，相对湿度50%～60%。

1.2 试剂与药物 兽用苯甲酸雌二醇注射液（宁波市三生药业有限公司，批号B131204）；黄体酮注射液（浙江仙琚制药股份有限公司，批号140620）；乳癖散结胶囊（陕西白鹿制药股份有限公司，批号150512）；他莫昔芬片（扬子江药业集团有限公司，批号15050811）。Trizol Reagent（美国Invitrogen Life Technologies 公司，批号15596-026）；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（美国 Thermo 公司，批号＃ K1622）；FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）（瑞士Roche 公司，批号04913914001）；BSA（北京索莱宝科技有限公司，批号A8020）；VEGF Rabbit PAb（武汉三鹰生物技术有限公司，批号00080369）；Bcl-2 Rabbit mAb（上海赛信通生物试剂有限公司，批号＃2870）；CA 蛋白定量检测试剂盒（批号G2026）、SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒（批号G2003）、PCNA Rabbit pAb（批号GB11010）、HRP-labeled Goat Anti-Rabbit IgG（批号GB23303）、Bax Rabbit pAb（批号GB11007-1）、两步法免疫组化试剂盒（批号G1210），均购自武汉塞维尔生物科技有限公司。

回乳抑增一号组方药材生麦芽、牡蛎、浙贝母、夏枯草、白芥子、山慈菇、昆布、郁金、玄参、丹参均由湖北天济中药饮片有限公司提供，经武汉市第三医院药学部中药检验室鉴定为正品，均符合2020 版《中国药典》 规定。上述药材经过浸泡后重复煎煮2 次，浓缩至含生药3.16 g/mL，在4 ℃下保存备用。

1.3 仪器 Neofuge15R 型台式高速冷冻离心机（香港Heal Force 公司）；Stepone plus 型荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司）；SW-CJ-1FD 型超净工作台（苏州苏净安泰空气技术有限公司）；FBZ2001-up-p 标准试剂型纯水仪（青岛富勒姆科技有限公司）；DYY-6C 电泳仪（北京六一仪器厂）；V300扫描仪（日本Epson 公司）；alphaEaseFC 灰度分析软件（美国Alpha Innotech 公司）；JB-P5 包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；RM2016 病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；XSP-C204 显微镜（重庆光电仪器有限公司）；ECLIPSE TI-SR 正置荧光显微镜、DS-U3 成像系统（尼康仪器上海有限公司）。

1.4 造模与分组 雌性未孕SD 大鼠56 只，常规喂养1 周后，随机分成正常组，模型组，中药阳性对照组（乳癖散结组），西药阳性对照组（他莫昔芬组），回乳抑增一号低、中、高剂量组，每组8只，造模方法参照文献的外源性激素苯甲酸雌二醇及黄体酮联合复制造模法［4]，正常组按每只0.1 mL生理盐水于大腿内侧肌肉注射，每天1 次，其余各组大鼠每天肌肉注射苯甲酸雌二醇注射液0.5 mg/kg，连续25 d，再每天肌肉注射黄体酮注射液5 mg/kg，连续5 d。

1.5 给药 造模完成后，正常组和模型组大鼠每天给予10 mL/kg 蒸馏水灌胃，乳癖散结组大鼠给予0.5 g/kg 混悬液，他莫昔芬组大鼠给予1.57 mg/kg混悬液，回乳抑增一号低、中、高剂量组大鼠分别按7.9、15.8、31.6 g/kg剂量灌服，每天1 次，连续30 d。

1.6 指标观察

1.6.1 乳腺组织病理学 造模完成后，每组各随机抽取1 只大鼠，二氧化碳处死，对乳腺组织进行病理学组织切片，HE 染色观察。

1.6.2 荧光定量PCR 法检测大鼠乳腺组织ERα、PR mRNA 表达 取大鼠乳腺组织，采用Trizol 法提取乳腺组织总RNA，将RNA 反转录成cDNA，定量PCR，反应条件为预变性95 ℃，10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火60 s，40 个循环，PCR仪采集荧光信号。以β-actin 为内参照基因进行校准，采用2-ΔΔCT法计算表达量。引物信息见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.6.3 大鼠乳腺组织PCNA、VEGF 蛋白表达的Western blot 检测 RIPA 裂解法抽提乳腺组织总蛋白，BCA 法测蛋白浓度，SDS-PAGE 凝胶电泳，将蛋白转至PVDF 膜上，5%牛奶封闭PVDF 膜1 h，一抗PCNA 多克隆抗体、VEGF 多克隆抗体稀释1 000倍，4 ℃孵育抗体3 h，然后TBST 清洗3 次。将二抗HRP-labeled Goat Anti-Rabbit IgG 用TBST 稀释3 000 倍，室温下孵育30 min 后，用TBST 在室温下脱色摇床上洗3 次，每次5 min。然后进行化学发光，将胶片进行扫描存档，PhotoShop 整理去色，Alpha 软件处理系统分析目标带的光密度值。

1.6.4 免疫组化检测Bcl-2、Bax 表达 取大鼠第2 对乳腺组织，4%多聚甲醛溶液固定，常规制片，采用免疫组化法检测。Image pro-plus 6.0 软件分析免疫组化图片，每张切片随机挑选5 个200 倍视野拍照，拍照时尽量让组织充满整个视野，应用IPP软件测定阳性表达面积及积分光密度值，算出单位面积平均光密度值（IOD/unit area）。

1.7 统计学方法 通过SPSS 22.0 软件进行分析，符合正态分布的计量资料以（）表示，组间比较采用单因素ANOVA 分析。 P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模后大鼠乳腺组织病理学观察 正常组大鼠乳腺组织腺泡分布均匀，小叶少见，导管形态正常，未见扩张；模型组大鼠病理特征明显，乳腺小叶面积增大，乳腺导管增生，腺泡数量增多，腺腔中可见大量分泌物，说明造模成功，见图1。

图1 大鼠乳腺组织病理形态（HE，×40）Fig.1 Pathological morphologies of rat mammary gland tissues（HE，×40）

2.2 对大鼠乳腺组织ERα、PR mRNA 表达的影响 与正常组比较，模型组ERα、PR mRNA 表达升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组ERα、PR mRNA 表达降低（P＜0.01），见表2。

表2 各组大鼠乳腺组织ERα、 PR mRNA 表达（，n=7）Tab.2 Expressions of ERα and PR mRNA in rat mammary gland tissues in various groups（，n=7）

表2 各组大鼠乳腺组织ERα、 PR mRNA 表达（，n=7）Tab.2 Expressions of ERα and PR mRNA in rat mammary gland tissues in various groups（，n=7）

注：与正常组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01。

2.3 对大鼠乳腺组织VEGF、PCNA 蛋白表达的影响 模型组大鼠乳腺组织PCNA、VEGF 蛋白表达量较正常组升高（P＜0.05）；与模型组比较，各治疗组均能下调PCNA、VEGF 蛋白表达（P＜0.01），见图2。

图2 各组大鼠乳腺组织VEGF、PCNA 蛋白表达（，n=7）Fig.2 VEGF and PCNA protein expressions in rat mammary gland tissues in various groups（，n=7）

2.4 对大鼠乳腺组织Bcl-2 和Bax 表达的影响 与正常组比较，模型组Bcl-2 表达升高（P＜0.01），Bax 表达降低（P＜0.01）；与模型组比较，各治疗组均能下调Bcl-2 表达（P＜0.01），上调Bax 表达（P＜0.01），见图3～4、表3。

表3 各组大鼠乳腺组织Bal-2、Bax 表达（，n=7）Tab.3 Bcl-2 and Bax expressions in rat mammary gland tissues in various groups（，n=7）

表3 各组大鼠乳腺组织Bal-2、Bax 表达（，n=7）Tab.3 Bcl-2 and Bax expressions in rat mammary gland tissues in various groups（，n=7）

注：与正常组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01。

图3 免疫组化法检测各组大鼠乳腺组织中Bcl-2 表达（×200）Fig.3 Bcl-2 expressions in rat mammary gland tissues in various groups by immunohistochemistry（×200）

3 讨论

乳腺增生是临床上最常见的良性乳腺疾病，临床表现是乳腺疼痛、结节状态或肿块，部分病人合并乳头溢液，有一定的癌变危险［1]。中医药治疗乳腺增生在临床的应用日益广泛，其作用机制是多靶点、多方位的发挥作用［5-7]。乳腺组织中雌激素含量增高，诱导体内合成ER 与PR 增多，而ER、PR 的增加会提高乳腺上皮细胞对雌激素的敏感性，导致乳腺增生的发生［8]。ER 分为ERα、ERβ，在ERα 基因敲除小鼠中证实，ERα 影响乳腺上皮细胞的增值与分化，是参与到小鼠乳腺腺泡不良病变的必要因素［9-11]。

图4 免疫组化法检测各组大鼠乳腺组织中Bax 表达（×200）Fig.4 Bax expressions in rat mammary gland tissues in various groups by immunohistochemistry（×200）

雌激素能使细胞外信号调节激酶EPK1/2 磷酸化，增加VEGF 的表达，引起乳腺组织中血管增生，诱导细胞增殖［12]。PCNA 的表达与细胞增殖密切相关，PCNA 指数已被列为评价细胞是否处于增殖状态的重要指标之一［13]。在正常情况下，机体内细胞增殖和凋亡处于动态平衡。乳腺增生的发病、加重、甚至癌变的过程就是乳腺上皮细胞增殖过度以及凋亡减弱的结果［14]，细胞凋亡与凋亡因子密切相关，Bcl-2 和Bax 分别为抑制凋亡和促进凋亡蛋白。

回乳抑增一号方中用活血、消痰、散结药配伍共同起到治疗乳腺增生作用。本实验结果证实回乳抑增一号能显著下调乳腺增生模型大鼠ERα、PR基因表达，阻断其与雌激素结合而产生的生物效应。与模型组比较，回乳抑增一号三个剂量组均能显著下调乳腺增生大鼠ERα mRNA 水平，而中剂量组对ERα 的调节作用更接近正常组，与正常组比较，回乳抑增中剂量组与他莫昔芬组ERα mRNA水平与正常组无显著差异，回乳抑增一号对ERα的调节作用与剂量有关，中剂量组作用优于高剂量组，从复方中分析其原因，方中麦芽用量较大，高剂量组麦芽已远超常规用量，可能影响了ERα 的下调作用，需要进一步研究麦芽剂量对乳腺ERα的影响。同时回乳抑增一号降低模型组大鼠乳腺组织VEGF、PCNA、Bcl-2 表达，上调Bax 表达，进而对细胞的增殖与凋亡产生影响，减缓乳腺增生大鼠的细胞增殖过程及激活细胞凋亡，综合发挥治疗乳腺增生的作用。