于洋君，伍 菱,2,3，何君竹，倪 辉,2,3，杨远帆,2,3,

(1.集美大学食品与生物工程学院，福建厦门 361021；2.福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建厦门 361021；3.厦门市食品生物工程技术研究中心，福建厦门 361021)

随着生活水平的逐渐提高和生活方式的改变，肥胖已经成为人类面临的主要健康问题之一。根据世界卫生组织的统计，2016年，全世界共有19亿成年人超重，超过3.4亿儿童和青少年超重或肥胖。超重人群(包括肥胖人群)已占全球人口的三分之一，中国的肥胖人群居世界首位[1]。肥胖和超重会增加人们患糖尿病、心血管疾病和癌症等慢性疾病的风险[2]。预防肥胖的方法之一是减少脂肪在人体内的消化吸收。

胰脂肪酶(EC 3.1.1.3)由胰腺腺泡细胞分泌，是消化脂肪的关键酶，因此，可通过抑制胰脂肪酶来降低肠道中脂肪的消化和分解，从而达到减少脂肪吸收，控制和治疗肥胖的目的[3-4]。目前，奥利司他是唯一一种被美国食品药物管理局批准并用于治疗肥胖症的胰脂肪酶抑制剂[5]，但由于是人工合成类药物，服用者可能会出现腹泻、胃肠不适、内分泌失调等不良反应，长期服用会造成人体肝和肾的严重损害[6]。所以，从植物中筛选副作用小的胰脂肪酶抑制剂逐渐成为研究热点。

羟基肉桂酸及其衍生物是广泛存在水果、蔬菜等植物中的一类酚酸类物质，具有抗炎、抗氧化、抑菌、降脂等生物活性功能[7]。对羟基肉桂酸乙酯是羟基肉桂酸的一种衍生物，同样具有抗氧化[8]、美白[9]和抗炎[10]的作用，但其是否有降脂的生物活性功能尚不明确。基于此，课题组前期从茶花粉中分离出了对羟基肉桂酸乙酯，证明了它的胰脂肪酶抑制作用，但尚未进一步研究其抑制机制。为明确其抑制机理，本文通过酶抑制动力学实验确定其抑制类型，采用分子对接技术初步探讨对羟基肉桂酸乙酯与胰脂肪酶的主要作用位点，以期为开发胰脂肪酶抑制剂及降脂功能食品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

对羟基肉桂酸乙酯 本课题组从茶花粉中分离纯化所得[11]，经高效液相色谱仪检测其纯度为98.25%；奥利司他、胰脂肪酶(来自猪胰EC 3.1.1.3，25000 U/mg)、4-硝基苯基丁酸酯(p-NPB) 美国Sigma-Aldrich公司；对硝基苯酚(PNP)、甲醇(分析纯)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、3-吗啉丙磺酸(MOPS)、二甲基亚砜(DMSO)、无水氯化钙 国药集团化学试剂有限公司。

EL104型电子分析天平 梅特勒-托利(上海)有限公司；SY-2-4型电热式恒温水浴锅 天津欧诺仪器仪表有限公司；KQ-5200DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；Epoch2T型酶标仪 美国伯腾仪器有限公司；QL-901型振荡器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 对羟基肉桂酸乙酯对胰脂肪酶的抑制作用

1.2.1.1 溶液配制 Buffer A：称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)6.05 g，溶于450 mL蒸馏水中，用盐酸缓慢滴定至pH=7.0，加入2.775 g的无水氯化钙并使其充分溶解，待溶液冷却至室温，定容至500 mL备用。

Buffer B：称取3-吗啉丙磺酸(MOPS)1.05 g，溶于450 mL蒸馏水，加入100 μL 0.5 mol/L EDTA的NaOH溶液，用盐酸调节至pH=6.8，待溶液冷却至室温，定容至500 mL备用。

底物p-NPB溶液的配制：称取4-硝基苯基丁酸酯(p-NPB)12.55 mg，溶于10 mL二甲基亚砜(DMSO)，配制成浓度为6 mmol/L的p-NPB溶液。

胰脂肪酶液的配制：称取胰脂肪酶10 mg，加入2 mL Buffer B缓冲液溶解，配制成浓度为300 U/mL的酶溶液，-4 ℃、10000 r/min条件下离心5 min，取上清液1 mL，加入2 mL Buffer B稀释为100 U/mL的胰脂肪酶溶液。

对羟基肉桂酸乙酯溶液的配制：精确称取一定量的对羟基肉桂酸乙酯，用甲醇稀释成浓度为10、20、30、40、50 μg/mL的对羟基肉桂酸乙酯溶液。奥利司他作为阳性对照。

1.2.1.2 胰脂肪酶抑制率测定 取1700 μL的Buffer A、60 μL的胰脂肪酶溶液(100 U/mL)和不同浓度的对羟基肉桂酸乙酯溶液(0、10、20、30、40、50 μg/mL)于2 mL离心管中，于37 ℃恒温水浴锅中温育15 min，取出后加入40 μL底物p-NPB(6 mmol/L)，再次放入37 ℃恒温水浴锅中温育15 min后取出，于405 nm波长下测定其吸光度[12]。以不加对羟基肉桂醛乙酯溶液的甲醇溶液为空白对照，以奥利司他(浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL)作为阳性对照。按照公式(1)计算对羟基肉桂酸乙酯对胰脂肪酶的抑制率。

式中：A1为胰脂肪酶+样品测得的吸光度值；A2为Buffer B + 样品测得的吸光度值；A3为胰脂肪酶+甲醇测得的吸光度值；A4为Buffer B+甲醇测得的吸光度值。

1.2.2 对羟基肉桂酸乙酯抑制胰脂肪酶的酶动力学特征

1.2.2.1 PNP溶液标准曲线的绘制 精确称取对硝基苯酚(PNP)0.007 g，用Buffer B缓冲溶液溶解并定容至10 mL，得到浓度为5 mmol/mL的PNP母液。用Buffer B缓冲溶液将母液稀释成浓度分别为90、80、70、60、50、40、30、20、10 μmol/mL的PNP溶液，以Buffer B缓冲液为空白对照，分别取上述浓度的PNP溶液各200 μL至96微孔板中，用酶标仪在405 nm下测定吸光度值，每个浓度做3个平行并取平均值。以不同的PNP溶液检测浓度为横坐标，测定的吸光度值为纵坐标，绘制PNP溶液标准曲线。

1.2.2.2 可逆作用类型的确定 参考Chai等[13]的方法，测定对羟基肉桂酸乙酯对胰脂肪酶的抑制动力学，通过固定底物p-NPB(6 mmol/L)的浓度，测定不同对羟基肉桂酸乙酯浓度(0、20、30、40、50 μg/mL)对不同浓度胰脂肪酶(0、60、80、100、120 U/mL)的酶促反应初速度。以胰脂肪酶溶液浓度为横坐标，反应初速度为纵坐标作图。根据所得线性拟合曲线是否通过坐标原点判断胰脂肪酶的抑制类型。

1.2.2.3 竞争作用类型的确定 固定胰脂肪酶浓度为100 U/mL，改变底物p-NPB浓度(0、1、2、4、6、8 mmol/L)，分别测定不同浓度对羟基肉桂酸乙酯(0、20、30、40、50 μg/ mL)的酶促反应速度，以p-NPB溶液底物浓度的倒数(1/[S])为横坐标，反应速率的倒数(1/V)为纵坐标绘制Lineweaver-Burk双倒数曲线，拟合得到的直线在x、y轴上的截距分别代表米氏常数Km和最大反应速率Vmax的倒数。抑制常数Ki可通过斜率与抑制剂浓度进行二次作图计算可得。根据直线与坐标轴交点位置判断胰脂肪酶的抑制类型[14]。

1.2.3 分子对接 从蛋白质晶体结构数据库(http://www.pdb.org/)中下载胰脂肪酶 (PDB ID: 1GPL)的晶体结构[15]，底物p-NPB和抑制剂对羟基肉桂酸乙酯的三维结构通过美国国力生物技术信息中心(NCBI)获得。对接前分别对受体蛋白和配体进行删除水分子、加氢等处理，通过Discovery Studio、AutoDock 4.2等分子对接软件进行分子对接[16]。

1.3 数据处理

所有实验均重复三次，采用Excel 2013及Origin Pro 9.0作图并进行数据分析处理。

2 结果与讨论

2.1 对羟基肉桂酸乙酯对胰脂肪酶的抑制作用结果

由图1可知，对羟基肉桂酸乙酯对胰脂肪酶有抑制作用，在实验浓度范围内(10～50 μg/mL)，随着其质量浓度的增加，对胰脂肪酶抑制作用增强，通过线性拟合计算其半抑制浓度IC50为41.07 μg/mL，阳性对照奥利司他IC50值为0.76 μg/mL。相比于其他天然产物中提取到的胰脂肪酶抑制剂，例如，王远等[17]用微波辅助提取法获得的辣木叶黄酮(IC50值为0.94 mg/mL)、孔霄等[18]研究的地参游离酚(IC50值范围为2.0305～3.0427 g/L)、褚盼盼等[6]研究的苦荞麦多糖(IC50值为28.23 mg/mL)，对羟基肉桂酸乙酯表现出较强的胰脂肪酶抑制作用。

图1 对羟基肉桂酸乙酯和奥利司他对胰脂肪酶的抑制作用

2.2 对羟基肉桂酸乙酯对胰脂肪酶的酶动力学研究

2.2.1 PNP溶液标准曲线的绘制 以不同浓度的

PNP溶液为横坐标，测定的吸光度值为纵坐标，所得的PNP溶液标准曲线如图2所示，PNP溶液标准曲线为y=0.0046x+0.0127，R2=0.9949，其中x为对硝基苯酚溶液的浓度，y为试样的吸光度值。通过该公式可以计算出不同吸光度对应的对硝基苯酚，进而测定胰脂肪酶活性。

图2 对硝基苯酚溶液标准曲线Fig.2 Standard curve of PNP solution

2.2.2 可逆抑制类型的确定 根据抑制剂与酶的结合方式不同，抑制类型分为可逆抑制和不可逆抑制。当抑制类型为不可逆抑制类型时，不同抑制剂浓度下的酶促反应速度曲线不通过坐标原点，曲线会相交于y轴；当抑制类型为可逆抑制时，不同抑制剂浓度下的酶促反应速度曲线均会通过坐标原点，且加抑制剂的曲线斜率比不加抑制剂时低[19]。由图3可知，在不同胰脂肪酶浓度下，每条线性拟合的曲线均通过坐标原点，且随着对羟基肉桂酸乙酯浓度的增加，其斜率逐渐降低，说明对羟基肉桂酸乙酯对胰脂肪酶属于可逆型抑制[20]，是通过非共价键的形式与酶结合，进而引起胰脂肪酶活力的降低或丧失[21]。

图3 对羟基肉桂酸乙酯对胰脂肪酶的抑制动力学曲线Fig.3 Inhibition kinetics curve of ethyl p-hydroxycinnamate toward pancreatic lipase

2.2.3 竞争抑制类型的确定 可逆型抑制分为竞争型抑制、非竞争型抑制和混合型抑制[22]。通过Lineweaver-Burk作图进一步确定可逆抑制类型[23]。由图4可知，直线斜率随对羟基肉桂酸乙酯浓度的增大不断增大，且相交于Y轴，表明对羟基肉桂酸乙酯对胰脂肪酶的作用类型为竞争型抑制[24]。根据竞争性抑制的特征，可以推断，对羟基肉桂酸乙酯作为抑制剂在与胰脂肪酶结合的时候与底物竞争活性中心的结合位点，从而达到抑制效果。计算得对羟基肉桂酸乙酯对胰脂肪酶的最大反应速率Vmax为2.61 μmol/L·min。图5为不同浓度对羟基肉桂酸乙酯的双倒数斜率对样品浓度进行的二次作图，计算得抑制常数Ki=114.35 μg/mL。在竞争性抑制类型中，酶的抑制常数可以表示酶和抑制剂络合物的解离常数，Ki值的大小能够反映酶和抑制剂络合物的解离难易程度，反映了抑制剂对酶的抑制能力大小[25-26]。单萍等[12]研究发现熊果酸对胰脂肪酶的抑制作用类型为竞争性抑制(半抑制率IC50值为1.87±0.05 mg/mL，抑制常数Ki=0.68±0.03 mg/mL)；Polzonetti等[27]发现橄榄苦苷对胰脂肪酶具有竞争性抑制，半抑制率IC50值为0.41 mmol/L，抑制常数Ki=0.19 mmol/L。对比发现，对羟基肉桂酸乙酯的抑制常数较小，表明酶与其络合物更难解离，对胰脂肪酶的抑制能力较强。

图4 对羟基肉桂酸乙酯对胰脂肪酶作用的Lineweaver-Burk曲线Fig.4 Lineweaver-Burk plots for inhibition of ethyl p-hydroxycinnamate on pancreatic lipase

图5 对羟基肉桂酸乙酯浓度对曲线斜率的影响Fig.5 The inpact of ethyl p-hydroxycinnamate concentration to curve slope of pancreatic lipase

2.3 分子对接

采用分子对接技术进一步研究对羟基肉桂酸乙酯对胰脂肪酶的抑制机理，并根据对接后的结合能来确定最佳结合方式，根据结合自由能越低，物质结合的越紧密，结合的状态越稳定的原理[28-29]，最优分子对接模拟结果如图6所示，对羟基肉桂酸乙酯和底物p-NPB均可在胰脂肪酶的活性中心相结合。

图6 对羟基肉桂酸乙酯与胰脂肪酶的分子对接模型Fig.6 Docking results between ethyl p-hydroxycinnamate and pancreatic lipase

对底物p-NPB和对羟基肉桂酸乙酯与胰脂肪酶对接的结果分别进行研究，得到p-NPB和对羟基肉桂酸乙酯与受体胰脂肪酶结合的3D和2D图。研究结果表明，p-NPB(图7A)和对羟基肉桂酸乙酯(图8A)均可进入胰脂肪酶的活性位点与酶活性中心氨基酸残基相互作用。如图7(B)所示，底物p-NPB与酶活性中心氨基酸残基Phe77、Ile209、Ala178和Leu213形成范德华力；与His263和Ser152形成氢键；与Pro180和Tyr114形成疏水作用力；与Phe215形成π键相互作用。当加入抑制剂对羟基肉桂酸乙酯时，其结合的氨基酸和作用力发生改变。从图8(B)可知，抑制剂对羟基肉桂酸乙酯与氨基酸残基Ile209、Glu179、Leu153和Thr78形成范德华力；与胰脂肪酶催化三联体[30]中的Ser152和His263形成氢键；与Tyr181、Pro180和Ala178形成疏水作用力；与Tyr114和Phe215形成π键相互作用；与Phe77形成C-H键。与底物p-NPB相比，增加了范德华力和疏水作用力。

对比图7(B)和图8(B)可知，抑制剂对羟基肉桂酸乙酯和底物p-NPB所结合的胰脂肪酶活性位点的氨基酸类似，如：Phe77、Ile209、Ala178、His263、Ser152、Pro180、Tyr114和Phe215，说明对羟基肉桂酸乙酯可以与p-NPB竞争酶的活性中心，通过占据酶的活性中心，导致底物p-NPB无法进入活性口袋，从而引起酶活力降低，为竞争型抑制[31]，此分子对接结果与抑制动力学结果一致。虽然结合的氨基酸残基类似，但是其作用力不同，这可能是导致对羟基肉桂酸乙酯比底物p-NPB更易与酶结合的原因。

图7 底物p-NPB与胰脂肪酶作用的3D(A)和2D(B)结构模型图Fig.7 3D (A) and 2D (B) structural simulation of p-NPB interacting with pancreatic lipase

图8 对羟基肉桂酸乙酯与胰脂肪酶作用的3D(A)和2D(B)结构模型图Fig.8 3D (A) and 2D (B) structural simulation of interacting with pancreatic lipase

3 结论

本研究采用从茶花粉中分离得到的对羟基肉桂酸乙酯，研究其对胰脂肪酶的抑制作用及抑制机理。研究结果表明，天然产物对羟基肉桂酸乙酯表现出潜在的胰脂肪酶抑制活性，其IC50为41.07 μg/mL。酶抑制动力学分析结果表明，对羟基肉桂酸乙酯对胰脂肪酶的作用类型为可逆竞争型抑制，其最大反应速率为2.61 μmol/L·min，抑制常数Ki=114.35 μg/mL。分子对接结果表明，对羟基肉桂酸乙酯可以与胰脂肪酶结合，并与底物p-NPB竞争酶的活性中心位点，进一步验证了对羟基肉桂酸乙酯对胰脂肪酶竞争性抑制的结论。此研究为对羟基肉桂酸乙酯的降脂机制及进一步开发利用茶花粉提供了理论依据。