刘梦培，李 佳，靳学远，王 霞，王维静，纵 伟,

(1.郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南郑州 450002；2.海南科技职业大学临床医药学院，海南海口 571126)

杜仲(Eucommia ulmoidesOliv.)为杜仲科杜仲属多年生落叶乔木，中国传统中草药，具有药食同源性[1]。传统多以皮入药，造成数万吨的杜仲叶腐烂损失[2]。现代药理研究表明，杜仲叶提取物具有抗炎、抑菌、降血压及免疫调节等功效[3-5]，且通过对杜仲叶毒理学安全性实验，验证了其食用安全性[6]。所以，利用杜仲叶的保健功能来开发功能性食品成为目前研究的热点。杜仲叶主要化学成分有木脂素类、环烯醚萜类、苯丙素类、黄酮类、多糖等化合物，包含多种单体化合物，在乳酸菌发酵杜仲提取液过程中伴随着大分子降解、代谢合成和生物转化等一系列生化反应，产生有益人体健康的新产物，使乳酸菌数量升高的同时，发挥其补益功效[7-8]。向敏等[9]也研究发现乳酸菌发酵可以改善桑叶的青草、腥味等，产生令人愉悦的花果香。因此，本文通过乳酸菌发酵杜仲叶水提物改善其风味，更易被人们接受。目前，对杜仲叶产品的研究较多集中在工艺、营养成分及理化性质等方面，如张丽华等[2]研究了添加不同益生元对植物乳杆菌发酵杜仲鲜叶饮料的影响，王翔等[10]研究了杜仲叶干品的营养价值和抗氧化能力，但对香气成分研究鲜为少见。

随着检测技术的发展，食品挥发性成分常用电子鼻技术(E-nose)和气相色谱-质谱(GC-MS)等分析方法进行评价。电子鼻是利用气体传感器阵列的响应图案来识别气味的电子系统，能快速识别简单和复杂的挥发性成分[11]，与气相色谱-质谱联用分析食品的挥发性组分，从而对其总体信息气味进行全面评估。而同时蒸馏萃取(simultaneous distillationextraction，SDE)法提取挥发性成分具有良好的重复性和较高的萃取量，对微量成分提取效率高，便于定量分析[12]。目前针对杜仲叶挥发性成分分析多采用GC-MS方法分析，研究方向多集中在杜仲皮、叶在有机溶剂中提取的挥发油的成分差异[13-14]，而对杜仲叶提取液发酵后香气物质的差异性研究尚不深入。因此，本实验选取4种乳酸菌菌种(植物乳杆菌、德式乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌)，分别对杜仲叶水提液进行发酵，采用SDE-GC-MS与电子鼻技术相结合的方式进行测试分析，探索不同乳酸菌发酵的杜仲叶水提液香气成分及发酵前后杜仲叶水提液香气成分的差异性，旨在为杜仲叶发酵食品开发、风味评价及工艺改进提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

杜仲叶 中国林科院杜仲研究基地；植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GIM1.191 中国微生物菌种保藏中心；嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)GIM1.540、德氏乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)GIM1.155、嗜酸乳杆菌(Lactobacillius acidophilus)GIM1.412 广东省微生物菌种保藏中心；MRS琼脂培养基、MRS肉汤培养基 北京奥博星生物技术有限责任公司；无水硫酸钠(分析纯) 国药集团化学试剂有限公司；二氯甲烷(色谱纯) 天津市富宇精细化工有限公司。

PAL-1数显折光糖度仪 日本ATAGO公司；BPH-9272型精密恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；JY92-2D型超声波仪 宁波新芝生物科技有限公司；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；HC-3618R高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；PEN3型便携式电子鼻传感器 德国Airsense公司；7890B-5977A气相色谱质谱联用仪 美国安捷伦公司；JY92-2D同时蒸馏萃取装置 郑州华峰试剂有限公司；RE-52 AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 杜仲叶水提液制备 杜仲鲜叶50 ℃烘箱烘干，杜仲干叶与蒸馏水按1∶20的比例50 ℃超声提取30 min，双层纱布过滤[10,15]，加入6%蔗糖(碳源)和1%的菊粉(益生元)，121 ℃灭菌20 min，冷却至37 ℃左右，涂布平板法检查无菌后使用。

1.2.2 杜仲叶水提液发酵 将甘油保藏的4种乳酸菌分别按接种量1%(v/v)接种到灭菌后的MRS液体培养基，37 ℃培养48 h，活化2代后菌液离心(4 ℃，6000 r/min，15 min)，倾去培养基，用无菌水洗涤沉淀2～3次后得到菌泥，再将其转入无菌水中振荡均匀，活菌数可达到106CFU/mL，接种量4%(v/v)接种到杜仲叶水提液发酵(37 ℃，48 h)。

乳酸菌检验参照GB 4789.35-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》[16]；杜仲叶发酵液的大肠杆菌检验参考GB 4789.3-2016《食品安全国家标准，食品微生物学检验，大肠菌群计数》[17]。

1.2.3 电子鼻传感器检测 PEN3型电子鼻传感器由10种金属氧化物半导体型化学传感元件组成，不同传感器的性能描述如表1所示。准确量取5 mL不同样品，放入样品瓶，50 ℃水浴10 min后，插入电子鼻探头吸取顶端空气，测定挥发性物质。电子鼻的设置参数为：样品间隔时间1 s，清洗时间100 s，归零时间5 s，样品准备时间5 s，测定时间80 s，载气流速400 mL/min，进样流量400 mL/min。传感信号在65 s后基本稳定，选定采集信号时间为70 s，连续测定10次，利用电子鼻自带的Win Muster软件对数据进行PCA及LoA。

表1 电子鼻传感器名称与其响应物质Table 1 Electronic nose sensors and their response to odorant compounds

1.2.4 SDE法萃取挥发性成分 取250 g杜仲发酵液，放入500 mL单口圆底烧瓶中，加入沸石，置于同时蒸馏装置重相端，采用电热套加热，温度控制在(100±1)℃范围内。另取50 mL色谱级二氯甲烷和适量沸石加入到100 mL圆底烧瓶中，置于同时蒸馏装置轻相端，采用水浴加热，温度控制在(55±1)℃范围内，左侧物料开始回流时计时，蒸馏萃取3 h。萃取结束后，收集有机溶剂萃取液，无水硫酸钠对萃取液进行干燥，冷藏过夜，过滤，将滤液旋转蒸发浓缩至约2 mL，进行GC-MS检测。

1.2.5 GC-MS分析条件 GC条件：HP-5MS型石英毛细柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，进样口温度250 ℃，载气为He，载气流量为1.0 mL/min；升温程序：起始温度40 ℃(保持2 min)，然后以3 ℃/min 的速度升到150 ℃(保持2 min)，再以6 ℃/min 的速率升到220 ℃(保持2 min)。进样方式：不分流，进样量0.5 μL。

MS条件：电子离子源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，全扫描模式，扫描质量范围为50～550 amu，溶剂延迟3 min。检索图库为NIST 2011。GC-MS测定结果通过NIST 2011图库检索，并用峰面积归一法测算各化学成分的相对含量。

1.2.6 气味活度值(ROAV)的计算方法 参考姚远等[18]的方法，利用相对气味活度值(ROAV)来描述发酵杜仲叶水提液香气物质对提取液主体风味的贡献，ROAV的计算公式如下:

式中，ROAVi代表各香气组分相对气味活度值；Ci和Ti分别为各香气组分的相对含量(%)和香气阈值(μg/kg)；Cmax和Tmax分别为对样品风味贡献最大的香气成分的相对含量(%)和香气阈值(μg/kg)。

一般认为，ROAV值越大的组分对样品总体香气的贡献也越大。且ROAV≥1的物质为所分析样品的关键香气成分。

1.3 数据处理

采用Origin 9.5和SPSS Statistics 32软件进行处理并制图。

2 结果与分析

2.1 不同乳酸菌发酵杜仲叶水提液的香气风味区分度分析

2.1.1 主成分分析(PCA) 主成分分析(Principal component analysis，PCA)是一种多元统计方法，用于解释样本之间的差异，通过电子鼻传感器对样品提取信息，降低数据矩阵的维数，建立了传感器与风味特征之间的相关性，得出贡献率最大和最主要的因子[19-20]。一般来说，贡献率越高，主成分反映原始多指标信息越好，总贡献率超过85%表明了方法的可行性[21]。从图1可以看出，第1主成分贡献率为89.43%，第2主成分贡献率为10.18%，累积贡献率为99.61%，大于95%，表明2个主成分已经能够反映样品的整体信息，可以代表样品挥发性风味的主要特征。同时每组样品测定数据在横、纵坐标上聚集度较高，说明同组样品的稳定性和重复性较好[22]。因此，PCA方法适用于不同乳酸菌发酵杜仲叶水提液后样品挥发性成分分析。

图1 不同乳酸菌发酵杜仲水提液后挥发性成分PCA图Fig.1 Linear discriminant analysis of volatile components of water extract of Eucommia ulmoides leaf fermented by different Lactobacillus species

通过比较各组图形的的横纵坐标发现，德式乳杆菌和嗜酸乳杆菌发酵后的杜仲叶水提液第1、2主成分差异不大，说明这两种菌发酵后的风味较为接近，而未发酵的杜仲叶水提液与其他4种乳酸菌发酵的杜仲叶水提液第1、2主成分差异较为明显，说明乳酸菌发酵后的风味与其未发酵风味差别较明显。结合表2所示，区分指数越接近1说明区分度越大，区分越明显。结合主成分分析图可以清晰地看出植物乳杆菌发酵组、德式乳杆菌发酵组、嗜酸乳杆菌发酵组、嗜热链球菌发酵组有明显的区分，且与未发酵组有明显区别。因此，利用电子鼻来区分不同乳酸菌发酵杜仲叶水提液的风味是非常有效的方法。

表2 不同乳酸菌发酵杜仲水提液电子鼻风味检测的判别指数Table 2 Discriminant index of e-nose flavor of water extract of Eucommia ulmoides leaf fermented by different Lactobacillus species

2.1.2 载荷分析(LoA) LoA(Loading Analysis)分析法，主要是对传感器进行研究，利用该分析法可以确定该实验条件下传感器的相对重要性，即样品区分过程中哪一类气味起主要区分作用[23]。如图2所示，若单个传感器的响应值越偏离于零，说明该传感器在识别中作用较大，从而确认为识别传感器[24]，结合图2可得7号(对硫化物灵敏)和9号(芳香成分，对有机硫化物灵敏)传感器对第一主成分区分贡献率最大，6号(对甲基类灵敏)和8号(对醇类、醛酮类灵敏)传感器对第二主成分区分贡献率最大；若单个传感器横、纵坐标的响应值趋近于零，则此传感器的识别作用较小可以忽略，即传感器1、2、3、4、5、10响应较小，对区分所起作用不明显；总体来说传感器6、7、8、9号发挥了较大的作用，即未发酵组与4组不同菌种发酵杜仲水提液的风味差异主要体现在硫化物、醇类、醛酮类、芳香类物质等。这表明在进行更深一步分析时，可以着重对响应大的6、7、8、9号传感器对应的风味化合物种类进行分析。因此，可以通过电子鼻分析来辅助区分不同乳酸菌发酵杜仲叶水提液的风味，与气相色谱分析法相互验证。

图2 不同乳酸菌发酵杜仲水提液后挥发性成分LoA分析图Fig.2 Loading analysis of volatile components of water extract of Eucommia ulmoides leaf fermented by different Lactobacillus species

2.2 不同乳酸菌发酵杜仲叶水提液的香气成分差异性比较

图3是主要香气化合物的类别分析。经SDEGC-MS分离和鉴定，未发酵挥发性成分共鉴定出31种，以醛类相对含量最高，为14.36%。4种乳酸菌发酵的杜仲叶水提液挥发性风味物质差异明显，其中植物乳杆菌发酵后鉴定出的挥发性成分为45种，以酮类相对含量最高，为18.83%；德式乳杆菌发酵后鉴定出的挥发性成分为38种，以杂环类相对含量最高，为24.84%；嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌发酵后鉴定出的挥发性成分分别为43、51种，均以醇类相对含量最高，分别为14.15%和19.03%。乳酸菌发酵对杜仲叶水提液的挥发性物质具有一定的影响，且四种菌种发酵有明显的区分，主要集中在醇类、醛类、酮类、杂环类物质，这与电子鼻PCA和LoA结果相一致。经乳杆菌发酵后的杜仲提取液，不仅挥发性成分数量较多，且主要香气成分含量增加显著，更有利于杜仲叶香气提升。

图3 不同乳酸菌发酵杜仲水提液后挥发性成分类别分析Fig.3 Loading analysis of volatile components of water extract of Eucommia ulmoides leaf fermented by different Lactobacillus species

2.3 不同乳酸菌种发酵杜仲叶水提液的香气特征分析

不同菌种发酵的杜仲叶水提液在相同条件下用G C-MS检测的定性和定量结果见表3。

表3 不同乳酸菌发酵杜仲叶水提液后挥发性成分的种类及相对含量Table 3 Species and relative contents of volatile components in Eucommia ulmoides leaf fermented by different Lactobacillus

续表3

2.3.1 醇类物质 醇类物质是乳酸菌发酵过程中一类重要的挥发性香气成分，大部分醇类物质的感知阈值较高，只有少量的高级醇能够赋予淡雅的花果香气[30]。4种乳酸菌发酵杜仲叶水提液挥发性成分中醇类物质均含有反-3-己烯醇、3-呋喃甲醇、苯甲醇、芳樟醇、苯乙醇、alpha-松油醇等。与未发酵液相比，苯甲醇、芳樟醇、苯乙醇、alpha-松油醇等香气成分含量明显提高。具有青草香气[29]的反-3-己烯醇，在嗜热链球菌发酵液中相对含量最高为4.9911%；3-呋喃甲醇在植物乳杆菌发酵后相对含量最高，为4.1968%；具有甜果香的苯甲醇和玫瑰香[26]的苯乙醇，在嗜酸乳杆菌发酵液中相对含量较高，分别为5.4991%、2.3751%；具有木青[31]和紫罗兰香气[32]的芳樟醇、alpha-松油醇，在德式乳杆菌发酵液中相对含量最高，分别为1.9920%、0.6162%。

2.3.2 醛类物质 醛类物质多为花香及果香，为杜仲叶复杂的清香气味提供了积极贡献。4种乳酸菌发酵样品挥发性成分中醛类物质均有3-糠醛、反式-2-己烯醛、反,反-2,4-庚二烯醛、桂皮醛。具有青香、蔬菜香[32]的反,反-2,4-庚二烯醛在未发酵液中相对含量最高为5.7457%；具有芳香气[33]的桂皮醛和3-糠醛在植物乳杆菌发酵后相对含量最高，分别为4.5180%、5.0227%；具有绿叶清香[34]的反式-2-己烯醛在德式乳杆菌发酵后相对含量最高，为3.4281%；具有杏仁味及花香[26]的苯甲醛、苯乙醛在嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌发酵后检测出，而在其它3组中未测出。且嗜热链球菌发酵液中苯甲醛、苯乙醛相对含量较高，分别为2.2924%、1.1134%。

2.3.3 酮类物质 酮类物质性质稳定，并且香气持久，一般具有花香气味。4种发酵杜仲叶水提液挥发性成分中共有的酮类物质有大马士酮、Alpha-大马酮、二氢-α-紫罗兰酮、α-异甲基紫罗兰酮等(前两者都具有类似玫瑰的芳香，后两者具有紫罗兰香气[35])，但含量差距较大。大马士酮和二氢-α-紫罗兰酮在德式乳杆菌发酵液中相对含量最高分别为6.9427%和3.4499%；Alpha-大马酮在未发酵液中相对含量最高为1.4008%；在所有甲基紫罗兰酮中香气最佳[36]的α-异甲基紫罗兰酮在植物乳杆菌发酵后相对含量最高为0.7623%。

2.3.4 其他类化合物 其他类化合物中杂环类物质在发酵前后的杜仲提取液中相对含量较高，可能是由于SDE法在加热过程中促使美拉德反应加剧生成一些许多含氮杂环化合物，如呋喃、吡喃、吡咯衍生物等[37]。酯类、酚类、酸类、烃类物质在发酵前后的杜仲提取液所占比例虽然较低，但是因其阈值不同，对杜仲液发酵后的风味同样起到重要作用。酯类物质多为花、果香。德氏乳杆菌发酵液中酯类物质相对含量较高，占总挥发性成分的2.4596%。具有果香气[38]的2,4-二叔丁基苯酚在嗜热链球菌发酵液中的相对含量是所有酚类物质里最高(3.5945%)。具有奶酪、酯香味[26]的己酸是植物乳杆菌发酵液特有的物质(相对含量0.5020%)。嗜热链球菌发酵液中检测到的苯乙烯是烃类物质中相对含量最高的为2.2924%。

2.4 不同乳酸菌种发酵杜仲叶水提液的关键香气成分分析

采用ROAV分析发酵杜仲叶水提液中主要香气物质对发酵液总体风味的贡献程度。根据表3中部分发酵液风味物质的香气阈值和相对含量，以德式乳杆菌发酵液中的大马士酮为ROAVmax=100，并计算样品中其它风味物质的ROAV，计算结果见表4。

未发酵的提取液有6种关键香气成分，对其风味贡献率大小依次为苯乙醛、大马士酮、芳樟醇、反,反-2,4-庚二烯醛、3-糠醛、反式-2-己烯醛；植物乳杆菌发酵液有7种关键香气成分，对其风味贡献率大小依次为大马士酮、3-糠醛、芳樟醇、二氢-α-紫罗兰酮、桂皮醛、反,反-2,4-庚二烯醛、反式-2-己烯醛；德式乳杆菌发酵液有7种关键香气成分，对其风味贡献率大小依次为大马士酮、芳樟醇、二氢-α-紫罗兰酮、反式-2-己烯醛、3-糠醛、反,反-2,4-庚二烯醛、桂皮醛；嗜热链球菌发酵液有8种关键香气成分，对其风味贡献率大小依次为大马士酮、苯乙醛、芳樟醇、二氢-α-紫罗兰酮、3-糠醛、反,反-2,4-庚二烯醛、反式-2-己烯醛、2,4-二叔丁基苯酚；嗜酸乳杆菌发酵液有9种关键香气成分，对其风味贡献率大小依次为大马士酮、芳樟醇、3-糠醛、苯乙醛、二氢-α-紫罗兰酮、对乙烯基愈疮木酚、反,反-2,4-庚二烯醛、桂皮醛、反式-2-己烯醛，其中对乙烯基愈疮木酚是嗜酸乳杆菌发酵液所特有的关键香气成分。

大马士酮、反,反-2,4-庚二烯醛、芳樟醇、3-糠醛、反式-2-己烯醛为5种样品共有关键香气成分，提供了主体的花香、果香和青叶香。具有绿叶青香的反,反-2,4-庚二烯醛、反式-2-己烯醛在未发酵提取液中贡献率较高，在发酵后的样品中明显下降。另外，发酵后产生独特花香气的二氢-α-紫罗兰酮，说明发酵过程不仅可以增加主体香气，还可以降低原本杜仲叶的青叶味，产生更浓郁的花香。

3 结论与讨论

通过SDE-GC-MS联用技术对乳酸菌发酵杜仲叶水提液的挥发性成分进行分析，研究结果表明，未发酵杜仲叶提取液的挥发性成分共鉴定出31种，以醛类相对含量最高(14.3591%)；植物乳杆菌发酵后鉴定出的挥发性成分为45种，以酮类相对含量最高(18.8255%)；德式乳杆菌发酵后鉴定出的挥发性成分为38种，以杂环类相对含量最高(25.7828%)；嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌发酵后鉴定出的挥发性成分分别为43和51种，均以醇类相对含量最高(14.1481%和18.3376%)。与未发酵杜仲叶提取液相比，嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、德氏乳杆菌、嗜热链球菌发酵后挥发性成分分别增加20、14、7、12种；4类主要挥发性物质相对含量分别增加了2、2、2.4、1.2倍。因此，经乳酸菌发酵后的杜仲叶提取液，不仅挥发性成分数量较多，且主要香气成分含量增加显著，更有利于杜仲叶提取液香气提升。通过电子鼻分析，PCA和LoA主成分贡献率均大于95%，香气成分差异与SDE-GC-MS检测结果相一致。

由ROAV分析可知，未发酵的杜仲叶提取液关键香气成分有6种，植物乳杆菌、德式乳杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌发酵的杜仲叶提取液关键香气成分依次为7、7、8和9种，其中大马士酮、反,反-2,4-庚二烯醛、芳樟醇、3-糠醛、反式-2-己烯醛为它们共有的香气成分。具有绿叶青香的反,反-2,4-庚二烯醛，反式-2-己烯醛在未发酵杜仲叶提取液中含量较高，发酵后显著下降。另外，发酵后产生独特花香气的二氢-α-紫罗兰酮，不仅可以增加主体香气，还可以降低原本杜仲叶的青叶味，产生更浓郁的花香。研究结果为杜仲叶相关产品的研发提供了参考依据。

表4 不同乳酸菌发酵杜仲叶水提液后关键香气成分分析Table 4 Analysis of key odor compounds in water extract of Eucommia ulmoides leaf fermented by different Lactobacillus