唐雅园，何雪梅，孙 健，游向荣，李昌宝，刘国明，盛金凤，李 丽，周 葵，易 萍，韦 珍，零东宁，唐 杰

(广西壮族自治区农业科学院农产品加工研究所，广西果蔬贮藏与加工新技术重点实验室，广西南宁 530007)

硒作为人体必需的15种微量元素之一。经现代流行病学调查及病理学研究发现，人类多种疾病(如癌症、心血管病等)的发生、发展都与人体缺硒密切相关[1-2]。硒元素的抗氧化活性是其重要的生物功能活性之一，多以硒酶和硒蛋白(例如谷胱甘肽过氧化物酶、硒代半胱氨酸)形态发挥作用[3-4]。

大米是我国人民的传统主食，其硒含量和形态与人体硒营养状况关系非常密切。大米对硒具有一定的生物富集作用，可将吸收的无机硒转化为有机硒。在富硒大米中，硒几乎不存在脂质中，少量以无机硒形式存在(约占总硒的2%)[5]；硒主要以有机硒形式存在，且超过总硒的50%结合于水溶性蛋白、盐溶性蛋白、醇溶性蛋白及碱溶性蛋白，因此，硒蛋白是富硒大米中硒的主要储存形态[6]。硒可显著提高谷类作物蛋白(如硒化大米蛋白[7]、硒化糯米蛋白[8]、硒化高粱蛋白[9]等)的抗氧化活性。从富硒大米的碱溶性蛋白中酶解出一种硒多肽，具有体内抗氧化活性[10]。从富硒大米的水溶性蛋白中分离出两种硒多肽，也具有一定抗氧化和神经保护能力[11]。目前，富硒大蒜、富硒花生、富硒灵芝等农产品中不同溶解性的硒蛋白的理化特性及其抗氧化活性均有相关研究报道[12-14]；而富硒大米中不同溶解性的硒蛋白的理化特性及其抗氧化活性的研究鲜见报道。

本文以产于广西高硒地区的富硒大米为原料，根据不同溶解性提取硒蛋白，对其理化特性进行研究，并结合体外试验研究其抗氧化活性，以期为富硒大米中硒蛋白的进一步研究和开发应用提供基础理论依据，对增加富硒大米附加值、开发天然有机硒补剂具有重要现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

富硒大米 广西省贵港市港南区高硒大田；甲基硒代半胱氨酸标准品、硒代半胱氨酸标准品 上海源叶生物科技有限公司；硒代甲硫氨酸标准品 上海麦克林生化科技有限公司；胃蛋白酶XIV(酶活力≥10000 U/g) 国药集团化学试剂有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美国Sigma公司；总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒 南京建成生物工程研究所。

3-18ks型台式高速冷冻离心机 美国Sigma公司；Genesys 10s型紫外-可见光分光光度计 美国Thermo Fisher Scientific公司；Agilent 7700X型电感耦合等离子体质谱仪 美国Agilent Technologies公司；5200Multi型全自动化学发光/荧光图像分析系统 上海天能科技有限公司；DYCZ-25E型电泳仪 北京六一生物科技有限公司；Nicolet iS50型傅里叶红外光谱仪 美国Thermo Fisher Scientific公司；Agilent 1290-6460型液相色谱仪质谱仪 美国Agilent Technologies公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大米粉制备 富硒大米于烘箱中50 ℃干燥8 h，用实验室规模的粉碎机磨粉后过80目筛，用塑料袋双层密闭低温保存备用。

1.2.2 硒蛋白制备 采用Osborne法[15]，对富硒大米蛋白进行分级提取，制备富硒大米中的水溶性硒蛋白(WSP)、盐溶性硒蛋白(SSP)、醇溶性硒蛋白(ESP)和碱溶性硒蛋白(ASP)。按照料液比1∶14(g/mL)向富硒大米中加入蒸馏水，45 ℃搅拌3 h；离心15 min后取上清液(沉淀①用于下一步分离)，用0.1 mol/L盐酸溶液调节到WSP等电点pH4.0；离心后取沉淀，经清水洗涤、冷冻干燥后得到WSP。采用3%氯化钠稀溶液为溶剂处理上一步剩余的沉淀①，料液比1∶10(g/mL)，45 ℃搅拌2 h；离心后取上清液(沉淀②用于下一步分离)，用0.1 mol/L盐酸溶液调节到SSP等电点pH4.3；离心后取沉淀，经清水洗涤、冷冻干燥后得到SSP。采用75%乙醇为溶剂处理上一步的剩余沉淀②，料液比1∶10(g/mL)，45 ℃搅拌2 h；离心后取上清液(沉淀③用于下一步分离)，用0.1 mol/L盐酸溶液调节到ESP等电点pH 5.5；离心后取沉淀，经清水洗涤、冷冻干燥得到ESP。采用稀氢氧化钠溶液为溶剂处理上一步剩余的沉淀③，料液比1∶8(g/mL)，调节溶液pH=9，45 ℃搅拌1.5 h；离心后取上清液，用0.1 mol/L盐酸溶液调节到ASP等电点pH4.6；离心后取沉淀，经清水洗涤、冷冻干燥后得到ASP。

1.2.3 蛋白质含量分析 采用考马斯亮蓝G-250法[16]。以牛血清白蛋白为标准品，在595 nm波长下测定富硒大米中各类蛋白的吸光度。

1.2.4 总硒含量测定 采用电感耦合等离子质谱(ICP-MS)法[17]测定富硒大米中各类蛋白的硒含量。称取一定量的蛋白样品放入石墨消解管中，按照料液比1∶6(g/mL)加入浓硝酸和30%过氧化氢(体积比8∶1，v/v)混合液。室温下放置15 min后，将样品消解管放置于石墨消解仪中加热消解。石墨消解仪升温时间为20 min，在160 ℃下密闭恒温消解30 min。消解完毕后，冷却至室温。将样品消解液转移至10 mL容量瓶中，用超纯水定容，混合均匀待测。同时，以超纯水做空白对照。使用硒同位素82Se绘制标准曲线(y=417.5464x+112.6577，R2>0.99)，仪器参数如表1所示。

表1 ICP-MS仪器运行参数Table 1 Operating parameters of ICP-MS

1.2.5 硒蛋白的亚基分子量分布测定 采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法[18]。使用的浓缩胶和分离胶质量浓度分别为4%和14%。将不同硒蛋白样品(蛋白浓度约为5 mg/mL)与5X蛋白上样缓冲液按4∶1比例混合，于沸水浴中加热10 min后以10000 r/min离心10 min。分别将20 μL不同硒蛋白样品和蛋白Marker注入样孔中。电泳初始时设置电压80 V，待硒蛋白样品进入分离胶时电压增加到120 V，当溴酚蓝指示剂迁移到靠近凝胶板底部时，停止电泳。固定液固定30 min后，用0.05%考马斯亮蓝R-250染色液染色30 min，用脱色液脱色直至蛋白条带清晰为止。最后将脱色后的凝胶置于凝胶成像系统中进行分析。蛋白Marker的分子量范围是10～170 kDa。

1.2.6 紫外扫描光谱分析 参照程利增[19]的方法，将干燥后的不同硒蛋白样品在缓冲液中溶解，配制成蛋白浓度为0.5 mg/mL。采用紫外-可见光分光光度计在190～900 nm范围扫描样品，得到紫外-可见扫描光谱。

1.2.7 傅里叶红外光谱(FT-IR)分析 参照蓝蔚青等[20]的方法，称取干燥后的不同硒蛋白样品与KBr粉末在玛瑙研钵中充分研磨混匀，压制成薄片，用傅立叶红外光谱仪在4000～500 cm-1波长范围进行扫描，Omnic 8.2软件绘制红外光谱图并进行对比分析。

1.2.8 硒代氨基酸组成分析 采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)法[21]对富硒大米ASP的硒代氨基酸进行定性和定量分析。称取适量蛋白样品，依次加入30 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液5 mL和20 mg胃蛋白酶XIV，涡旋混匀，放于37 ℃恒温箱中孵育24 h[22]，酶解后以10000 r/min离心10 min，取上清液过0.45 μm滤膜上机测定。色谱柱为Waters T3(2.1 mm×100 mm，3 μm)；流动相为(A)0.1%甲酸水溶液和(B)乙腈；流速为0.3 mL/min；柱温为25 ℃；进样量为5 μL；采集模式为ESI+。洗脱梯度为0 min，95%A；0.5 min，95%A；5 min，50%A；6 min，0%A；7 min，0%A；7.1 min，95%A；8.5 min，95%A。

1.2.9 硒蛋白的抗氧化活性分析

1.2.9.1 总抗氧能力(T-AOC)测定 体外总抗氧化能力采用Fe3+还原试剂盒测定，大米硒蛋白中的抗氧化成分能使Fe3+还原成Fe2+，而后者可与菲啉类物质形成稳固的络合物[23-24]。大米硒蛋白总抗氧化能力参照试剂盒使用说明进行检测。

1.2.9.2 1,1-二苯基苦酰基苯肼(DPPH)自由基清除能力测定 参考Tang等[25]的方法，移取2 mL不同浓度硒蛋白样品或无水乙醇，加入2 mL的DPPH溶液，涡旋混匀，避光静置于室温30 min后，于517 nm处测定吸光度值。DPPH自由基清除率按公式(1)计算：

式中，Ao为DPPH溶液吸光度值；Ai为DPPH溶液和硒蛋白样品溶液的混合溶液的吸光度值；Aj为硒蛋白样品溶液的吸光度值。

1.3 数据处理

所有试验数据均测定3次，并以平均值±标准差(Mean±SD)表示。采用IBM SPSS Statistics 26软件进行方差分析、显著性差异分析及相关性分析。

2 结果与分析

2.1 富硒大米中不同硒蛋白的蛋白含量和硒含量比较

采用考马斯亮蓝法和ICP-MS法分别测定富硒大米中不同硒蛋白的蛋白含量和硒含量。由表2可知，ASP是富硒大米硒蛋白中最主要的蛋白质。不同溶解性的大米蛋白的硒含量依次为ASP>WSP>ESP>SSP。其中，ASP硒含量约为WSP、ESP和SSP硒含量的1.5、6.0和7.1倍。张涛等[26]研究也表明碱溶性蛋白提取液的硒含量占总硒含量的48%，是富硒大米中主要的硒蛋白形式。由于ESP提取率过低，故后面的研究主要集中于WSP、SSP和ASP这3种蛋白。

表2 不同硒蛋白的蛋白含量、硒含量的比较Table 2 The comparsion of protein and selenium contents of different Se-proteins

2.2 富硒大米中不同硒蛋白的SDS-PAGE分子量及亚基组成比较

采用SDS-PAGE法研究富硒大米中不同硒蛋白分子量的分布及亚基组成，结果如图1所示。分析比较WSP、SSP和ASP的SDS-PAGE电泳图，由图1可以看出，不同硒蛋白的亚基条带不同，说明其亚基组成有一定差异，因此所包含的亚基结构也不相同。根据蛋白质分子量的分布，WSP主要亚基分布在19.69 kDa；SSP分子量范围是15.33～55.12 kDa，主要亚基分布在19.10和15.33 kDa；而ASP未见主要亚基条带，说明ASP可能具有更小的亚基分子量。这可能是因为ASP在提取过程中碱溶液对蛋白破坏较大，小分子蛋白增多。小分子蛋白在一定程度上更有利于人体的消化吸收[27]。

图1 富硒大米中不同硒蛋白SDS-PAGE电泳图Fig.1 SDS-PAGE analysis of different Se-proteins from selenium-enriched rice

2.3 富硒大米中不同硒蛋白的紫外-可见光光谱分析

富硒大米中3种硒蛋白(WSP、SSP和ASP)在190～900 nm进行全波长扫描，其结果如图2所示。WSP、SSP和ASP均在190～400 nm范围内有较强的吸收峰。根据紫外吸收峰的位置，可将大米硒蛋白的紫外-可见光光谱图分成2个区域。3种硒蛋白在238 nm附近均有较大吸收峰，此吸收峰来源于大米硒蛋白中所含的肽键；在280 nm附近有一较弱的肩峰，此吸收峰来源于大米硒蛋白中所含的芳香族氨基酸(苯丙氨酸、络氨酸、色氨酸)[28]。

图2 富硒大米中不同硒蛋白的紫外-可见光光谱图Fig.2 UV-Vis spectra of different Se-proteins from selenium-enriched rice

2.4 富硒大米中不同硒蛋白的红外光谱分析

傅立叶红外光谱(FT-IR)是分析蛋白结构的常用手段之一。富硒大米WSP、SSP和ASP在4000～500 cm-1范围内进行红外光谱分析扫描，其结果如图3所示。由图3可知，3种富硒大米蛋白的红外光谱图线基本相似。在波数3300 cm-1附近出现较强的吸收峰，这是由于酰胺基团中的N-H和分子间、分子内的-OH的伸缩振动所引起的。在波数2920 cm-1附近出现的吸收峰是饱和碳C-H伸缩振动而产生的。在波数1650 cm-1左右出现窄而尖的吸收峰属于酰胺I带，是由C=O的伸缩振动产生的，是蛋白质的特征谱带；在波数1530 cm-1附近有相对较弱的吸收峰，此为酰胺II带，由硒蛋白分子中的N-H伸缩振动引起，也是蛋白质的特征谱带[29]。在波数1035 cm-1附近出现的吸收峰属于S-O的反对称伸缩振动峰。此外，在680～770 cm-1间有特征峰为对称环伸缩振动引起的，可能有Se=O或C-Se结构[30]。

图3 富硒大米中不同硒蛋白的红外光谱图Fig.3 FT-IR spectra of different Se-proteins from selenium-enriched rice

2.5 富硒大米中碱溶性硒蛋白的硒代氨基酸组成分析

通过对富硒大米及其副产物的研究发现，水稻从外环境中吸收的无机硒(Se(VI)和Se(IV))通常先转化为硒代半胱氨酸(Selenocysteine，SeCys)，再进一步转化为硒代甲硫氨酸(Selenomethionine，SeMet)、甲基硒代半胱氨酸(Methylselenocysteine，MeSeCys)等其他有机硒的形态[31]，其中SeCys是第21种编码氨基酸，而SeMet能够非特异性替代甲硫氨酸残基存在于蛋白分子中[32]。因此，SeMet、SeCys和MeSeCys这三种氨基酸是富硒大米中主要的硒代氨基酸类型，而目前市面上硒代氨基酸标准品较少，SeMet、SeCys和MeSeCys标准品稳定性较高。另外，通过对WSP、SSP和ASP的理化特性和功能活性进行分析，发现相较于其他硒蛋白，ASP是富硒大米中主要的蛋白成分，且含硒量最高，抗氧化能力也最强。因此，本研究主要针对大米ASP中的这3种硒代氨基酸进行定性和定量分析。

本研究采用1种非特异性蛋白水解酶断开ASP蛋白链中的肽键[22]，使之尽可能完全水解，用色谱与质谱在线联用分析其中的硒代氨基酸，确定大米ASP中与蛋白结合的硒形态，结果见图4。通过MRM模式进行检测，选择质核比m/z 56.1、181.0、198.0，m/z 88.1、247.7、337.1和m/z 94.9、166.9、184.2分别作为SeMet、SeCys和MeSeCys的特征离子对。同时，结合标准品色谱图可知SeMet、SeCys和MeSeCys的保留时间分别是1.968、1.045和1.427 min。结果表明，ASP中存在3种硒代氨基酸，其中SeCys含量为(300.22±6.88)ng/g，MeSeCys含量为(170.19±2.87) ng/g，而SeMet含量低于50 ng/g。通过查阅相关文献可知植物中的硒主要是和甲硫氨酸结合[33-34]，但在ASP酶解液中仅发现少量SeMet，可能是由于它在酶解过程中被氧化。

图4 富硒大米ASP中3种硒代氨基酸的色谱图和质谱图Fig.4 LC-MS chromatograms of three seleno-amino acids in ASP from selenium-enriched rice

2.6 富硒大米中不同硒蛋白的抗氧化活性比较

2.6.1 总抗氧化能力(T-AOC) 由图5可知，富硒大米中WSP、SSP、ASP和VC(对照)对Fe3+均有一定的还原力，且随着浓度的增加而呈现上升趋势。不同硒蛋白的T-AOC强弱顺序为ASP>WSP>SSP，而VC的T-AOC总体高于硒蛋白。

2.6.2 DPPH自由基清除能力 如图6所示，富硒大米中WSP、SSP、ASP与VC(对照)均具有一定的DPPH自由基清除能力。不同硒蛋白的清除能力与其浓度均呈正相关性，而VC对DPPH自由基的清除率随着浓度的增加基本保持不变。相同浓度下，ASP对DPPH自由基的清除率明显高于其他2种蛋白。当蛋白浓度为10 mg/mL时，WSP、SSP、ASP及VC对DPPH自由基的清除率分别为30.73%、24.77%、65.20%、97.11%。

图6 富硒大米中不同硒蛋白的DPPH自由基清除能力Fig.6 DPPH free radical scavenging capacity of different Se-proteins from selenium-enriched rice

2.6.3 富硒大米中硒蛋白抗氧化活性与其硒含量的相关性分析 为确定WSP、SSP和ASP的抗氧化活性与其硒含量之间的相关性，分析了二者之间的皮尔逊(Pearson)相关系数。从表3可以看出，3种硒蛋白抗氧化活性和其硒含量之间的相关性均表现为极显著的正相关性(P<0.01)，表明硒蛋白中的硒对其抗氧化作用具有显著增强作用。由此可见，富硒大米硒蛋白具有的抗氧化活性源于其含有具有抗氧化能力的硒元素或含有较高含量具有抗氧化活性的硒代氨基酸。此结果与Zeng等[35]的研究一致。

表3 富硒大米中硒蛋白抗氧化活性与其硒含量的相关性分析Table 3 Correlation analysis of antioxidant activities and selenium contents in Se-proteins from selenium-enriched rice

3 结论

以富硒大米为原料，对3种不同溶解性的大米硒蛋白的理化特性及其抗氧化活性进行了研究。硒蛋白是富硒大米中最重要的含硒成分，其中碱溶性蛋白中硒含量最高。3种大米硒蛋白的蛋白分子量和亚基条带不同，表明其亚基组成和结构均有一定差异，其中碱溶性硒蛋白以小分子蛋白为主。3种硒蛋白的紫外及红光光谱图线基本相似，并未观察到特殊的特征峰。分析大米碱溶性硒蛋白酶解产物中的硒代氨基酸发现，除硒代半胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸外还含有少量硒代甲硫氨酸。此外，3种大米硒蛋白的总抗氧化能力、DPPH自由基清除能力与样品浓度之间呈良好的量效关系，其抗氧化活性从强到弱为碱溶性硒蛋白>水溶性硒蛋白>盐溶性硒蛋白。这3种大米硒蛋白抗氧化活性与其硒含量之间的相关性分析表明，二者之间存在极显著正相关性(P<0.01)。综上，大米中碱溶性硒蛋白是进一步纯化和研究较为理想的提取物，对天然有机硒补剂的开发有潜在的应用价值。