李 菲，李 娟，张振杰，侯 林，崔清华，田景振*

1.山东第一医科大学（山东省医学科学院）药学院，新发传染病病因流行病学重点实验室，山东 泰安 271016

2.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355

A6 型柯萨奇病毒（coxsackievirus A6，CV-A6）属于小核糖核酸病毒科的肠道病毒A 组，自2013年逐渐成为手足口病暴发流行的主要病原体之一[1-3]。CV-A6 不同于CV-A16 和71 型肠道病毒（enterovirus 71，EV71），后两者P1 区序列相似度极高，靶受体、致病机制和抗病毒药物等方面存在相同或相似之处[4]，EV-71 的相关研究为CV-A16 的研究和应对奠定了良好基础，目前CV-A6 的相关研究较少[5]。

清热解毒类中药不仅能够抗病毒、消炎、退热，还能提高人体免疫力，治疗病毒性感染疾病具有多靶点、整体调节的特点[6-7]。灌肠给药具有良好的安全性和顺应性，适合中药发挥复方优势[8]。银花青蒿栀子方源于名老中医经验方，组方为金银花3～15 g、青蒿6～25 g 和栀子3～12 g，具有清热解毒、疏风解表的功效[9]。近年来，研究发现该方开发的中药制剂对甲型H1N1 流感病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒及肠道病毒EV71 和CV-A16 等均有抑制作用[10-11]。基于课题组前期研究发现银花青蒿栀子方具有抗CV-A6 作用，制备了银花青蒿栀子方灌肠剂，本研究考察银花青蒿栀子方灌肠剂体内抗CV-A6 的作用，并初步探讨其作用机制。

1 材料

1.1 动物

ICR 孕鼠16 只，8 周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号SCXK（京）2012-0001）。动物饲养于温度（22±1）℃、湿度（55±5）%的环境中，自由进食饮水。动物实验符合山东第一医科大学动物实验伦理学规定（批准号2018049）。

1.2 病毒和细胞

CV-A6引自中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所毒种室；人横纹肌瘤细胞RD 引自中国预防医学研究所病毒研究室。

1.3 药材

金银花（批号 20170306）、青蒿（批号20170306）、栀子（批号20170306）均购自泰安市金泰联药店，经山东第一医科大学高洪莉教授鉴定分别为忍冬科忍冬属植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾、菊科蒿属植物黄花蒿Artemisia annuaL.的干燥地上部分、茜草科栀子属植物栀子Gardenia jasminoidesElis 的干燥果实。

1.4 药品与试剂

银花青蒿栀子方灌肠剂（批号20170923）、多克隆抗体为本实验室自制；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；qPCR 试剂盒（批号03907）购自天根生化科技有限公司；Trizol（批号1705263）购自美国 Invitrogen 公司；转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）ELISA 试剂盒（批号128170744）购自联科生物；Procarta Plex多因子检测试剂盒（批号148087012）购自美国eBioscience 公司；HRP 标记的羊抗鼠IgG 抗体（批号G1211）购自Servicebio 公司；Tunnel 试剂盒（批号11684817910）、DAPI（批号216276）购自瑞士Roche 公司；山羊血清（批号AR1009）购自博士德生物工程有限公司。

1.5 仪器

1300 A2 生物安全柜、371 型CO2恒温培养箱、7500 Fast 荧光定量PCR 仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；倒置显微镜（日本尼康株式会社）；Infinite M 200 Pro 酶标仪（瑞士Tecan 公司）；MAGPIX 液相芯片分析系统（美国Luminex 公司）；石蜡切片机、EMUC7 型超薄切片机（德国Leica公司）；JEM-1200EX Ⅱ型透射电子显微镜（TEM，日本电子株式会社）。

2 方法

2.1 银花青蒿栀子方灌肠剂的制备

将金银花、青蒿、栀子粉碎为粗粉，分别称取上述药材粗粉120、600、80 g，加入8 倍量55%乙醇浸泡2 h，超声提取30 min，提取2 次，抽滤，合并滤液，40 ℃减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10；加入3%聚山梨酯-80 超声分散均匀，加入3%水溶性氮酮和0.2%山梨酸钾，以氢氧化钠溶液调节pH 值至6.8，加入纯化水至1 L，得到0.8 g/mL（以生药量计）的褐色澄清灌肠剂。

2.2 造模、分组与给药

10日龄ICR 乳鼠随机分为对照组、模型组、银花青蒿栀子方灌肠剂（2.6 g/kg）[11]组和利巴韦林（10 mg/kg）组，每组14 只。除对照组外，其余各组ip 0.1 mL CV-A6（滴度为107.4TCID50/mL）。银花青蒿栀子方灌肠剂组感染后1 h 内灌肠25 μL 药物，利巴韦林组im 药物，模型组和对照组灌肠等体积纯化水，2 次/d，连续14 d。第4 天各组随机取4 只乳鼠，乙醚吸入麻醉后内眦取血，分离血清，-80 ℃保存，用于细胞因子测定；取心脏、肺脏、脊髓、延髓和后肢骨骼肌组织，-80 ℃保存，用于病毒载量测定。

2.3 银花青蒿栀子方灌肠剂对CV-A6 感染的ICR乳鼠血清中细胞因子水平的影响

按ELISA 试剂盒说明书测定血清中TGF-β 水平；按Procarta Plex 多因子检测试剂盒说明书测定血清中白细胞介素-4（interleukin 4，IL-4）、IL-5、IL-6、IL-12 p70、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和γ 干扰素（interferon-γ，IFN-γ）水平。

2.4 银花青蒿栀子方灌肠剂对CV-A6 感染的ICR乳鼠心脏、肺脏、脊髓、延髓和后肢骨骼肌组织病毒载量的影响

取冻存的心脏、肺脏、脊髓、延髓和后肢骨骼肌组织，加入液氮研磨，按照试剂盒说明书提取各组织总RNA 并合成cDNA，进行qRT-PCR 分析。引物及探针序列：上游引物5’-CCTGAATGCGGCTAATCC-3’，下游引物5’-TTGTCACCATWAGCAGYCA-3’，探针5’-FAM-CCGACTACTTTGGGWGTCCGTGT-BHQ1-3’。

2.5 银花青蒿栀子方灌肠剂对CV-A6 感染的ICR乳鼠生存率和临床评分的影响

每天观察、记录乳鼠的症状变化，统计生存率，按照文献方法[12]对临床症状进行评分。

2.6 银花青蒿栀子方灌肠剂对CV-A6 感染的ICR乳鼠心脏、肺脏、脊髓、延髓和后肢骨骼肌组织病理变化的影响

末次给药3 h 后，各组其余动物脱颈椎处死，取心脏、肺脏、脊髓、延髓和后肢骨骼肌组织，于10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，制备厚度为5 μm 的切片，进行HE 染色，于显微镜下观察。

2.7 银花青蒿栀子方灌肠剂对CV-A6 感染的ICR乳鼠脊髓颈膨大段超微结构的影响

取脊髓颈膨大段，于2.5%戊二醛、1%四氧化锇中固定，梯度乙醇脱水，环氧树脂包埋，制备厚度为50～60 nm 超薄切片，进行醋酸铀-枸橼酸铅双染色，于TEM 下观察。

2.8 银花青蒿栀子方灌肠剂对CV-A6 感染的ICR乳鼠心脏、肺脏、脊髓、延髓和后肢骨骼肌组织病毒抗原表达的影响

取心脏、肺脏、脊髓、延髓和后肢骨骼肌组织，以自制多克隆抗体[13]为一抗，HRP 标记的羊抗鼠IgG 抗体为二抗，进行免疫组织化学染色，于显微镜下观察，采用Image J 软件分析阳性区域的吸光度（A）值。

2.9 银花青蒿栀子方灌肠剂对CV-A6 感染的ICR乳鼠骨骼肌组织细胞凋亡的影响

取“2.6”项下骨骼肌石蜡切片，脱水后用组化笔画圈，加入10%山羊血清，室温封闭30 min；吸除血清，加入Tunnel 反应混合液，37 ℃孵育1 h；TBS 洗涤3 次，5 min/次；滴加DAPI 染色，避光室温孵育10 min；TBS 洗涤，以抗荧光衰减封片剂封片，于荧光显微镜下观察。

2.10 统计学处理

3 结果

3.1 银花青蒿栀子方灌肠剂对CV-A6 感染的ICR乳鼠血清中细胞因子水平的影响

如图1所示，与对照组比较，模型组乳鼠血清中IL-5、IL-6、IL-12 p70、TNF-α、IFN-γ 和TGF-β均显著升高（P＜0.001）；与模型组比较，银花青蒿栀子方灌肠剂组乳鼠血清中IL-5、IL-6、IL-12 p70、TNF-α、IFN-γ 和TGF-β 水平均显著降低（P＜0.01、0.001）。

图1 银花青蒿栀子方灌肠剂对CV-A6 感染的ICR 乳鼠血清中IL-5、IL-6、IL-12 p70、TNF-α、IFN-γ 和TGF-β 水平的影响Fig.1 Effect of Yinhua-Qinghao-Zhizi Enema on levels of IL-5,IL-6,IL-12 p70,TNF-α,IFN-γand TGF-β in serum of CV-A6 infected ICR mice

3.2 银花青蒿栀子方灌肠剂对CV-A6 感染的ICR乳鼠心脏、肺脏、脊髓、延髓和后肢骨骼肌组织病毒载量的影响

如图2所示，模型组乳鼠骨骼肌、延髓、脊髓、心脏和肺组织中的病毒载量均较高，其中骨骼肌组织的病毒载量最高；与模型组比较，银花青蒿栀子方灌肠剂显著降低了后肢肌、脊髓、延髓、心脏和肺组织的病毒载量（P＜0.05、0.01）。

图2 银花青蒿栀子方灌肠剂对CV-A6 感染的ICR 乳鼠心脏、肺脏、脊髓、延髓和后肢骨骼肌组织病毒载量的影响Fig.2 Effect of Yinhua-Qinghao-Zhizi Enema on viral load in heart,lungs,spinal cord,medulla oblongata and hind limbs skeletal muscle tissue of CV-A6 infected ICR mice

3.3 银花青蒿栀子方灌肠剂对CV-A6 感染的ICR乳鼠生存率和临床评分的影响

如图3所示，10日龄ICR 乳鼠ip 感染CV-A6，5 d 后开始出现急性弛缓性麻痹（acute flaccid paralysis，AFP）的典型症状，14 d 后生存率为10%。银花青蒿栀子方灌肠剂组较少出现AFP 症状，运动能力较正常，临床评分低，给药14 d 后生存率为70%，药效优于利巴韦林。

图3 银花青蒿栀子方灌肠剂对CV-A6 感染的ICR 乳鼠生存率和临床评分的影响Fig.3 Effect of Yinhua-Qinghao-Zhizi Enema on survival rate and clinical score of CV-A6 infected ICR mice

3.4 银花青蒿栀子方灌肠剂对CV-A6 感染的ICR乳鼠心脏、肺脏、脊髓、延髓和后肢骨骼肌组织病理变化的影响

如图4所示，与对照组相比，模型组乳鼠骨骼肌出现严重的肌纤维溶解、断裂，肌束稀疏；脊髓前角和延髓中的神经元出现变性、坏死；心肌泡沫化，心肌纤维有轻度的溶解、断裂；肺组织出现严重的纤维化。银花青蒿栀子方灌肠剂组骨骼肌基本无肌束断裂，肌纤维排列较为整齐；脊髓前角和延髓中的神经元坏死程度有一定改善；心肌无出血现象，心肌纤维排列较为整齐；肺纤维化程度明显减轻，肺泡形态接近正常。

图4 银花青蒿栀子方灌肠剂对CV-A6 感染的ICR 乳鼠心脏、肺脏、脊髓、延髓和后肢骨骼肌组织病理变化的影响(HE,×200)Fig.4 Effect of Yinhua-Qinghao-Zhizi Enema on pathological changes in heart,lungs,spinal cord,medulla oblongata and hind limbs skeletal muscle tissue of CV-A6 infected ICR mice(HE,× 200)

3.5 银花青蒿栀子方灌肠剂对CV-A6 感染的ICR乳鼠脊髓颈膨大段超微结构的影响

如图5所示，对照组脊髓前角神经元细胞器丰富，在核周分布均匀，有丰富的粗面内质网平行排列，核糖体颗粒丰富，形成发育良好的尼氏体区域（图5-A），髓鞘板层结构排列整齐（图5-B），核内染色质均匀，核仁大而圆，线粒体呈椭圆形，嵴清晰（图5-C）。模型组脊髓前角神经元细胞器数量明显减少，粗面内质网扩张并有脱颗粒，核糖体颗粒分散，未形成尼氏体；核膜凹凸不平，核仁变小，异染色质在核边缘聚集；胞质广泛水肿，线粒体肿胀变形，基质稀疏，大部分嵴膜不清甚至消失，外膜膨胀隆起，形成空泡（图5-D）；髓鞘板层结构紊乱，出现囊性间隙，中间有纤维填充（图5-E）；呈现嗜神经现象（图5-F）。银花青蒿栀子方灌肠剂组脊髓前角神经元细胞接近正常，粗面内质网基本为平行状排列，水肿减轻，游离核糖体减少，表明细胞合成功能旺盛，有利于神经轴突的修复（图5-I）；线粒体形态较改善，数量增加（图5-G）；髓鞘板层结构散乱和分离程度减轻（图5-H）。利巴韦林组脊髓前角神经元细胞器粗面内质网逐渐恢复正常的平行状排列，游离核糖体减少（图5-J），线粒体形态较改善，异染色质在核边缘聚集（图5-L）；髓鞘板层结构散乱，中间有纤维填充（图5-K）。

图5 银花青蒿栀子方灌肠剂对CV-A6 感染的ICR 乳鼠脊髓颈膨大段超微结构的影响(×10 000)Fig.5 Effect of Yinhua-Qinghao-Zhizi Enema on ultrastructure of spinal cord slices in CV-A6 infected ICR mice(× 10 000)

3.6 银花青蒿栀子方灌肠剂对CV-A6 感染的ICR乳鼠心脏、肺脏、脊髓、延髓和后肢骨骼肌组织病毒抗原表达的影响

如图6所示，病毒抗原在模型组乳鼠后肢骨骼肌中病毒表达最为严重，脊髓和延髓的神经元和胶质细胞有病毒抗原分布，病毒抗原在心脏中的分布相对较少，在肺组织中分布广泛。与模型组相比，银花青蒿栀子方灌肠剂组后肢骨骼肌、脊髓、延髓、心脏和肺组织的阳性表达均减少。如表1所示，银花青蒿栀子方灌肠剂组骨骼肌和肺组织病毒抗原表达明显减少（P＜0.05）。

图6 银花青蒿栀子方灌肠剂对CV-A6 感染的ICR 乳鼠心脏、肺脏、脊髓、延髓和后肢骨骼肌组织病毒抗原表达的影响(×200)Fig.6 Effect of Yinhua-Qinghao-Zhizi Enema on viral antigen expression in heart,lungs,spinal cord,medulla oblongata and hind limbs skeletal muscle tissue of CV-A6 infected ICR mice(× 200)

表1 银花青蒿栀子方灌肠剂对CV-A6 感染的ICR 乳鼠心脏、肺脏、脊髓、延髓和后肢骨骼肌组织病毒抗原表达的影响Table 1 Effect of Yinhua-Qinghao-Zhizi Enema on viral antigen expression in heart,lungs,spinal cord,medulla oblongata,and hind limbs skeletal muscle tissue of CV-A6 infected ICR mice

表1 银花青蒿栀子方灌肠剂对CV-A6 感染的ICR 乳鼠心脏、肺脏、脊髓、延髓和后肢骨骼肌组织病毒抗原表达的影响Table 1 Effect of Yinhua-Qinghao-Zhizi Enema on viral antigen expression in heart,lungs,spinal cord,medulla oblongata,and hind limbs skeletal muscle tissue of CV-A6 infected ICR mice

与对照组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05#P <0.05 ##P <0.01 vs control group;*P <0.05 vs model group

组别 剂量/(g·kg-1)A 值骨骼肌 脊髓 延髓 心脏 肺对照 — 0.09±0.02 0.09±0.01 0.09±0.00 0.09±0.01 0.09±0.01模型 — 0.21±0.04## 0.18±0.03## 0.16±0.03# 0.15±0.02# 0.19±0.04##利巴韦林 0.01 0.16±0.02 0.12±0.02 0.13±0.01 0.13±0.02 0.15±0.02银花青蒿栀子方灌肠剂 2.60 0.15±0.01* 0.14±0.03 0.12±0.01 0.12±0.01 0.13±0.02*

3.7 银花青蒿栀子方灌肠剂对CV-A6 感染的ICR乳鼠骨骼肌组织细胞凋亡的影响

如图7所示，与对照组相比，模型组乳鼠骨骼肌凋亡细胞增多；与模型组相比，各给药组乳鼠骨骼肌凋亡细胞减少，表明银花青蒿栀子方灌肠剂对病毒导致的肌细胞凋亡具有抑制作用。

图7 银花青蒿栀子方灌肠剂对CV-A6 感染的ICR 乳鼠骨骼肌组织细胞凋亡的影响(×200)Fig.7 Effect of Yinhua-Qinghao-Zhizi Enema on muscle cell apoptosis of CV-A6 infected ICR mice(× 200)

4 讨论

手足口病典型临床症状为发热，手、口、足、臀等部位出疹，部分患儿出现无菌性脑膜炎、脑炎、AFP 等重症表现[14]。ICR 乳鼠感染CV-A6 后出现的主要症状为AFP，银花青蒿栀子方灌肠剂能够提高病毒感染得乳鼠生存率，改善其临床症状。ICR 乳鼠感染CV-A6 后多个组织脏器发生病理损伤，其中骨骼肌病理严重损伤、脊髓前角神经元坏死、延髓的锥体束受损与其症状表现主要为AFP 有一定的关联性。银花青蒿栀子方灌肠剂能够减轻骨骼肌、脊髓、肺脏等组织的病理损伤，降低病毒抗原表达。ICR 乳鼠感染CV-A6 后骨骼肌、脊髓、延髓和肺组织中病毒载量高，与骨骼肌和脊髓是EV71 复制并传播到脑组织的重要部位相似[15]；银花青蒿栀子方灌肠剂显著降低上述组织中的病毒载量，体现出良好的抗CV-A6 活性。

病毒侵犯脊髓前角灰白质区运动神经元，导致肌肉特别是肢体肌肉发生不对称弛缓性麻痹。EV71感染的乳鼠骨骼肌细胞和Vero 细胞中线粒体空泡化，表明线粒体可能是其直接损伤靶点[16]。本研究发现CV-A6 感染导致脊髓组织的超微结构发生明显改变，如前角神经元线粒体发生肿胀变形、形成空泡等；银花青蒿栀子方灌肠剂组脊髓组织神经元细胞的形态结构趋于正常，表明银花青蒿栀子方灌肠剂对CV-A6 致神经元细胞结构损伤有改善作用。

病毒感染可以通过多个信号通路触发宿主细胞凋亡，凋亡的发生可以促进病毒和炎性细胞因子的释放，是病毒感染导致临床病症和病理改变的原因之一[4,17]。EV71 和CV-A16 均通过半胱氨酸蛋白酶（Caspase）途径诱导宿主细胞凋亡[18-19]。本研究结果显示，银花青蒿栀子方灌肠剂能够抑制CV-A6 致骨骼肌细胞凋亡，从而抑制病毒和炎性细胞因子的释放，减轻病毒感染导致的症状和病理损伤，发挥抗病毒作用。

病毒感染可以过度激活机体免疫系统，引发机体产生细胞因子风暴[20-21]，细胞因子风暴导致局部与全身的炎性反应，造成组织损伤、器官功能的丧失甚至死亡[22]。人感染登革病毒后，血清中IL-8、IFN-γ、TGF-β 和IL-10 水平升高[23]；Balb/c 小鼠感染CV-B3 后，血清中IL-6、IL-12（p40）、IL-12（p70）、IL-17α、IFN-γ、TNF-α 水平均显著升高[24]。本研究结果显示，CV-A6 感染导致ICR 乳鼠血清中多种细胞因子水平显著升高，与文献结果一致[25]；与模型组比较，银花青蒿栀子方灌肠剂显著降低血清中TGF-β、IL-5、IL-6、IL-12 p70、TNF-α 和IFN-γ 水平，从而减轻细胞因子风暴导致的炎性损伤，发挥抗病毒作用。

综上，本研究发现银花青蒿栀子方灌肠剂具有良好的抗CV-A6 作用，能够提高CV-A6 感染的ICR乳鼠生存率并改善临床症状，可能与其减少脊髓前角神经元细胞结构损伤、抑制骨骼肌细胞凋亡、干预细胞因子风暴、保护脏器功能等有关。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突