尚方剑 王洁 邢诒彰 王辉 庄辉发 赵青云

(1 海南大学园艺学院 海南海口 570228;2 中国热带农业科学院香料饮料研究所 海南万宁 571533;3 海南省热带香辛饮料遗传与改良品质调控重点实验室 海南万宁 571533)

香草兰又名香荚兰，享有“食品香料之王”誉称，其豆荚经发酵生香加工后可产生200多种香气成分，被广泛应用于制作各种高档食品和化妆品，附加值高，用途广泛［1］。墨西哥香草兰（Vanilla planifoliaAndrews）是主栽种，占世界香草兰总种植面积的90%以上，品质佳，但抗病能力弱，易感染土传病害；大花香草兰（Vanilla pomponaSchiede）是香草兰的3 大栽培种之一，品质仅次于墨西哥香草兰；大香草兰（Vanilla siamensisRolfe ex Downie）和帝皇香草兰（Vanilla imperialisKraenzl）是栽培香草兰野生近缘种，植株生长旺盛，茎蔓粗壮，具有耐寒、抗病害等优良性状，是开展香草兰目标性状育种的重要资源［2］。

土壤微生物是土壤生态环境的重要组成部分［3］，参与多种生物化学反应，是土壤有机物质转化的执行者，为植物生长发育提供矿质营养，对土壤生态系统中植物健康生长有直接或间接的影响［4］。土壤微生物多样性会随着环境条件的变化而发生改变，是生态环境健康稳定的基础［5］。土壤微生物群落功能多样性是反映土壤微生物群落特征的重要指标之一［6］。植物种类、品种是影响根际微生物组成和功能作用的关键因素［3］。同一作物不同品种间植株根系招募的微生物类群有差异，微生物群落结构不同［7］。Yao 等［8］研究表明，不同黄瓜品种根际土壤细菌结构和组成存在明显差异。Mendes 等［7］研究指出，不同大豆品种根际细菌群落结构不同，抗病品种根际可富集类芽孢杆菌关键菌群。然而，不同种香草兰根际土壤微生物群落是否存在差异，其根际土壤微生物群落功能多样性有何不同，目前国内外尚未见研究报道。

本研究以主栽种及野生近缘种香草兰种植园土壤为研究对象，通过Biolog-ECO 微平板法［9-10］研究其根际土壤微生物对31 种碳源的利用情况，明确不同种香草兰根际土壤微生物群落功能多样性差异，以期为调控主栽种墨西哥香草兰土壤微生物群落，从根际微生态角度改善土壤微生物功能，从而提升其抗逆能力提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

选取2～3 年园龄的墨西哥香草兰（V. planifolia）、大花香草兰（V. pompona）、帝皇香草兰（V. imperialis）和大香草兰（V. siamensis）种植园，分别随机采取3 株，采用抖土法收集根际土壤［11-12］，将样品装入封口袋中，带回实验室。部分土壤样品自然风干，通过1 mm 筛孔，用于测定土壤pH、碱解氮、速效磷、速效钾；通过0.15 mm 筛孔，用于测定土壤有机质、全氮。部分土壤样品分置于4℃冰箱保存，用于测定土壤微生物群落功能多样性。

1.2 方法

1.2.1 指标测定

称取新鲜土，采用烘干称重法测定土壤含水量。称取通过1 mm 筛孔的风干土，采用水浸提电位法，土∶水＝1∶2.5（m/V）测定土壤pH，采用碱解扩散法测定碱解氮，采用NaHCO3浸提—钼锑抗比色法测定有效磷，采用NH4OAc 浸提—火焰光度法测定速效钾［13］。称取通过0.15 mm筛孔风干土，采用有机元素分析仪（Euro Vector EA 3000）测定全氮；采用总有机碳测定仪（Multi N/C 3100/1，German） 测定土壤有机碳，换算成土壤有机质（土壤有机质含量＝土壤有机碳含量×1.724）。土壤样品理化性质见表1。

利用Biolog-ECO 微平板法研究不同种香草兰根际土壤微生物功能多样性［14］。每样品称取2 g土壤，倒入18 mL 0.85%无菌生理盐水中，之后置于200 r/min 摇床振荡30 min，静止15 min；吸取上清液，用生理盐水稀释至10-3倍；将制备好的土壤菌悬液接种于Biolog-ECO 微孔板中，每孔接种125 μL，置于28℃恒温培养箱中培养；分别于培养的 24、48、72、96、120、148、168 h 用酶标仪测定波长为590 nm处的吸光值。

表1 土壤理化性质

1.2.2 数据计算

Biolog-ECO 微孔板中有31 种不同碳源，微生物利用碳源过程中与四唑盐染料反应发生颜色变化，颜色深浅表明微生物对碳源的利用程度［15］。AWCD值（平均颜色变化率，Average Well Color Development），用于评价土壤微生物群落利用31种碳源的能力［16-17］。采用培养 72 h 的吸光度［14，18］值 计 算 Shannon-Wiener （H′） 多 样 性 指 数 、Simpson（D）优势度指数、McIntosh（U）多样性指数、丰富度指数（S），评估微生物群落的丰富度、均匀度和多样性等［18］。

式中：Ci表示第i孔在590 nm 处的吸光值，R表示对照孔的吸光值，n表示Biolog-ECO微孔板上碳源数量；Pi表示第i孔的相对吸光值（C-R）除以整个微孔板相对吸光值的总和；ni表示第i孔的相对吸光值；S表示吸光值＞0.15的碳源。

1.2.3 数据分析

数据采用SPSS 20.0 软件进行ANOVA 方差分析和多重比较（LSD，p＜0.05）；采用Biolog-ECO 微平板培养72 h 的吸光值数据进行碳源分类及主成分分析，利用Microsoft Excel 2019 做柱状图和主成分分析图（PCA）。

2 结果与分析

2.1 四种香草兰根际土壤微生物利用总碳源的能力

如图1所示，不同种香草兰根际土壤微生物群落平均颜色变化率（AWCD 值）随培养时间延长呈上升趋势，利用碳源能力不断增强。在培养24 h内，大香草兰和大花香草兰根际土壤微生物AWCD值无显著差异，增长幅度显著低于墨西哥香草兰和帝皇香草兰；培养24～144 h，不同种香草兰根际土壤微生物AWCD 值均大幅增加，碳源的利用率快速增大，144 h 后碳源的利用率趋于平缓。在72 h时，帝皇香草兰AWCD值与墨西哥香草兰、大香草兰、大花香草兰相比，分别增加了9.1%、48.4%、76.1%；在整个培养周期，帝皇香草兰和墨西哥香草兰AWCD 值增长速率显著大于大香草兰和大花香草兰，且帝皇香草兰对碳源利用能力在96 h 内显著高于墨西哥香草兰，96～168 h 与墨西哥香草兰无显著差异。由此可见，不同种香草兰根际土壤微生物利用碳源能力不同，帝皇香草兰根际土壤微生物利用碳源能力最强，土壤微生物群落代谢活性最高。

图1 四种香草兰根际土壤微生物利用总碳源情况

2.2 四种香草兰根际土壤微生物利用各类碳源能力

Biolog-ECO 微平板中的31 种碳源分为6 类，碳水化合物、氨基酸、羧酸、多聚物、酚酸、胺类。由图2 可知，4 种香草兰根际土壤微生物群落利用各类碳源的能力不同。在培养168 h 期间，帝皇香草兰土壤微生物群落对碳水化合物类碳源利用能力显著高于其他3种香草兰，大花香草兰土壤微生物群落利用碳水化合物的能力最弱（图2-A）。墨西哥香草兰和帝皇香草兰土壤微生物群落利用氨基酸类碳源的能力无显著差异，但均显著高于大香草兰和大花香草兰（图2-B）。培养72 h 后帝皇香草兰土壤微生物群落利用羧酸类碳源能力低于墨西哥香草兰，但高于大香草兰（图2-C）。在培养72 h 之前，帝皇香草兰土壤微生物群落利用多聚物类碳源能力增幅最大，显著高于其他种香草兰，但72 h 后增长速率趋于平缓，与墨西哥香草兰无显著差异（图2-D）。在168 h 时，帝皇香草兰土壤微生物群落对酚酸类碳源利用能力最弱，墨西哥香草兰、大香草兰、大花香草兰分别是帝皇香草兰的2.0、1.8 和1.7 倍（图2-E）。在168 h时，不同种间对胺类碳源的利用能力差异显著，墨西哥香草兰利用率较高，与帝皇香草兰、大花香草兰、大香草兰相比，分别增加了16%、26%和50%（图2-F）。由此可见，4 种香草兰根际土壤微生物群落对各类碳源有不同偏好，帝皇香草兰根际土壤微生物群落利用碳水化合物、氨基酸、多聚物类碳源能力较强，对酚酸类碳源利用能力最弱；墨西哥香草兰根际土壤微生物群落对酚酸、胺类和羧酸类碳源利用能力较强。

2.3 四种香草兰根际土壤微生物群落多样性指数分析

利用Biolog-ECO 微平板培养72 h 的吸光值计算Shannon-Wiener多样性指数、Simpson优势度指数、McIntosh 多样性指数和丰富度指数，分析土壤微生物群落功能多样性。由表2可知，Shannon-Wiener 多样性指数在3.071～3.162，墨西哥香草兰和帝皇香草兰无显著差异，但均显著高于大香草兰和大花香草兰。Simpson 优势度指数在0.946～0.952，墨西哥香草兰和帝皇香草兰无显著差异，但均显著高于大香草兰和大花香草兰。帝皇香草兰McIntosh 多样性指数与墨西哥香草兰、大香草兰、大花香草兰相比，分别增加了6.8%、39.5%和65.4%。墨西哥香草兰丰富度指数为28，显著高于其他3种香草兰，大香草兰和大花香草兰无显著差异。综上表明，帝皇香草兰和墨西哥香草兰土壤微生物物种多样性和优势度高，帝皇香草兰土壤微生物均匀度高，墨西哥香草兰土壤微生物对碳源的利用种类多。

图2 四种香草兰根际土壤微生物群落利用各类碳源能力

2.4 四种香草兰根际土壤微生物利用碳源主成分分析

对4 种香草兰根际土壤微生物群落利用31 种碳源的数据进行PCA分析，根据主成分分析提取原则（特征值＞1），提取了3 个主成分，其中PC1（主成分1）和PC2（主成分2）的方差贡献率分别为47.06%、26.95%，累积方差贡献率为95.45%。大香草兰处于PC1 轴负方向和PC2 轴的正方向，与大花香草兰距离较近，土壤微生物群落结构相似，对碳源的利用能力相似（图3）。帝皇香草兰在PC1上明显区分于大花香草兰和大香草兰，在PC2上明显区别于墨西哥香草兰，且墨西哥香草兰与大香草兰及大花香草兰距离较远，说明4种香草兰根际土壤微生物群落结构差异显著，对碳源利用能力有较大差异；帝皇香草兰根际土壤微生物群落结构与墨西哥香草兰、大香草兰和大花香草兰明显不同；大香草兰和大花香草兰根际土壤微生物群落结构相似。

表2 四种香草兰根际土壤微生物群落功能多样性指数分析

图3 四种香草兰根际土壤微生物群落利用碳源能力主成分分析

由主成分分析相关矩阵可知，对PC1贡献最大的有17 种碳源（表3），主要包括：6 种碳水化合物（D-木糖、β-甲基D-葡萄糖苷、D-纤维二糖、葡萄糖-1-磷酸盐、I-赤藻糖醇、D，L-α-甘油）；3种羧酸（丙酮酸甲酯、衣康酸、D-苹果酸）；3种氨基酸（L-天冬酰氨酸、L-丝氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸）；2 种多聚物（肝糖、α-环式糊精）；2 种胺类（苯乙基胺、N-乙酰基-D-葡萄糖胺）；1 种酚酸，即2-羟基苯甲酸。对PC2 贡献最大的有5 种碳源，主要包括2种碳水化合物（α-D-乳糖、D-半乳糖醛酸），1 种羧酸（γ-羟基丁酸），1 种酚酸（4-羟基苯甲酸）和1 种胺类（腐胺）。对PC1 影响最大的碳源是碳水化合物、羧酸、氨基酸；对PC2影响最大的碳源是碳水化合物。碳水化合物、羧酸、氨基酸是不同种香草兰土壤微生物群落利用的主要碳源。

3 讨论

不同品种、不同植物基因型影响土壤微生物群落多样性和代谢活性［8］。杨炜迪等［19］研究了5种牧草根际土壤微生物功能多样性，发现不同牧草品种根际土壤微生物在代谢活性、微生物多样性指数和不同种类碳源利用能力方面均存在差异。张明莉等［20］研究发现，外来种意大利苍耳与本地种苍耳根际土壤微生物功能多样性和对各类碳源的利用效率差异显著。本研究通过分析4种香草兰根际土壤微生物群落对总碳源的利用能力发现，不同种香草兰根际土壤微生物对总碳源的利用能力均随培养时间增加呈上升趋势，土壤微生物活性增强，144 h 后逐渐趋于平缓，土壤微生物活性趋于稳定。赵兰凤等［21］对广东省不同区域菜园土壤微生物群落进行了研究，结果显示土壤微生物群落AWCD 值随培养时间延长呈先升高后趋于平稳的趋势，与本研究结果相似。抗病种帝皇香草兰根际土壤微生物总体碳代谢活力高于其他3种香草兰（图1）。Yao 等［8］研究了不同抗性黄瓜品种根际土壤微生物利用碳源能力，发现易感病黄瓜品种根际土壤微生物利用碳源能力低于抗病品种，这可能是抗病种土壤微生物群落功能多样性较高的原因［8］。

土壤微生物群落功能多样性指数被广泛应用于评价土壤微生物群落多样性变化和土壤微生物群落组成。Shannon-Wiener 多样性指数反映土壤微生物物种的多样性［22］；Simpson优势度指数反映土壤微生物群落物种优势度［22］；McIntosh 多样性指数反映土壤微生物群落的均匀度［21］；丰富度指数反映物种可利用的碳源数量［18，23］。张旭龙等［24］研究表明，不同品种油葵根际土壤微生物群落功能多样性指数差异明显。由表2可得出，不同种香草兰根际土壤微生物群落功能多样性指数不同，帝皇香草兰根际土壤微生物群落多样性、优势度和均匀度高，微生物种类高度协调，而墨西哥香草兰根际土壤微生物利用的碳源数量多，微生物种群丰富。

表3 PC1和PC2相关的碳源种类

由图2可知，帝皇香草兰根际土壤富集较多的可利用碳水化合物、氨基酸、多聚物的微生物，墨西哥香草兰根际土壤富集较多的可利用酚酸和胺类物质的微生物，这可能与其根系分泌物组成不同有关。植物根系分泌物为土壤微生物提供丰富的营养，影响根际土壤微生物群落结构［4］。Kwak 等［25］研究发现，2 个不同抗性番茄品种根际微生物菌群结构明显不同。农泽梅等［26］研究发现，不同品种甘蔗根际微生物优势菌群存在明显差异。张旭龙［24］等研究表明，不同品种油葵盐碱地土壤微生物对碳源利用能力存在差异，影响了盐碱地土壤微生态环境。基于主成分分析（PCA）结果，不同种香草兰根际土壤微生物对碳水化合物、羧酸类和氨基酸类碳源利用能力较强（表3），说明不同种香草兰根际土壤均富集了可利用碳水化合物、羧酸和氨基酸的微生物，引起不同种香草兰土壤微生物群落变化的碳源为碳水化合物、羧酸类和氨基酸类物质。杨炜迪［19］等研究发现，不同牧草品种根际土壤微生物利用的主要碳源为碳水化合物类、氨基酸类和羧酸类。李慧等［27］研究也指出，碳水化合物和氨基酸类碳源是5种草原植物根际土壤微生物利用的主要碳源。因此，不同种香草兰根际土壤微生物群落多样性不同，可能与其根系分泌物不同有关。

综上，4 种香草兰根际土壤微生物群落功能多样性和对各类碳源的偏好均不同，其中，野生抗病种帝皇香草兰根际土壤微生物代谢活性、群落多样性、物种优势度和均匀度较高，利用碳源能力强。本研究为从根际微生态角度改善主栽种香草兰土壤菌群结构，从而提升其抗性提供理论基础。