陈晓雨 张建 张新亚 唐雨婷 邵钰晨 罗志丹 卢辰

（1.江苏海洋大学江苏省海洋药物活性分子筛选重点实验室，连云港 222005；2.江苏省海洋资源开发研究院（连云港），连云港 222005）

Tth DNA聚合酶是一种从嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）分离得到的耐热DNA聚合酶［1］。与同样来源于栖热菌属的Taq DNA聚合酶不同，在仅有Mg2+存在时，Tth DNA聚合酶表现出一般的DNA聚合酶活性；但还有Mn2+存在条件下，该酶同时具有耐高温逆转录酶活性和DNA聚合酶的活性［2］。因此自1990年发现Tth DNA聚合酶后，研究者很快将其尝试用于丙型肝炎、流感病毒等RNA病毒的逆转录-荧光定量PCR检测［3-5］。更重要的是，Tth DNA聚合酶对于血液、肌肉等生物组织中含有的PCR抑制成分具有较强的耐受性［6-7］，十分适合用于粗样本快速检测［8］。然而，野生型Tth DNA聚合酶存在比活力低［9-10］、热稳定性不如Taq DNA聚合酶［11］、Mn2+影响PCR扩增保真性［12］等缺陷，阻碍了其广泛应用。

近年来，随着蛋白质工程技术的发展，研究者开始重新审视Tth DNA聚合酶的改造和应用［13-15］。在此过程中，如何快速准确测定Tth DNA聚合酶的活性，是准确评估蛋白质改造和生产工艺优化效果的前提。目前测定DNA聚合酶活力的方法主要有：（1）同位素标记法，利用同位素3H标记的dNTP，把30分钟内在最适反应温度下将10 nmol dNTP掺入酸不溶物所需的酶量定义为1个活力单位（U），该方法最为准确，也是国内外主流厂商约定俗成的DNA聚合酶活力定义标准。但受限于同位素操作资质与放射性防护条件，很难在普通实验室实现。（2）琼脂糖凝胶电泳或荧光定量PCR法，使用已标定酶活的对照品与样品扩增同样的模板，通过比较产物凝胶电泳条带亮度或荧光定量PCR的Ct值来计算样品活性相对于对照品的倍数。……