王 丽，耿生莲

(1.青海大学农林科学院，青海 西宁 810016；2.青海大学农牧学院，青海 西宁 810016； 3.青海省高原林木遗传育种实验室，青海 西宁 810016)

引言

园林绿化不仅可以改善城市人居环境、减轻环境污染，还具有调节气候、丰富物种多样性等多种功能，是提升城市生态环境质量最为重要的途径之一。不同气候背景下的城镇绿化需充分考虑当地环境和资源基础，在遵循适地适树原则的基础上稳步推进绿化工程建设。青藏高原地区平均海拔在3500m以上，气温低，热量资源不足[1]，树种的抗寒性是高原城镇绿化需要关注和考量的重要方面。

低温对植物的危害，按低温程度和受害情况，可分为冻害和冷害两种。植物在长期进化过程中，对低温有其特殊的适应方式，其中就包括低温适应引发的生理生化变化，以增强植物对冷胁迫的适应能力[2]。低温引发的生理指标变化部分与膜的通透性改变有关。低温胁迫可导致膜相的改变，以及由于膜损伤而引发的代谢紊乱。通过细胞电解质外渗率的变化可反映出植物受伤害的程度，使用Logistic方程进行拟合，用拐点温度表示组织的半致死温度(LT50)，可得到与真实情况较为接近的抗寒性比较结果。这种方法受浸泡时间的影响很小[3]，因此被广泛用于植物的抗寒性鉴定[4-5]。近年来，围绕保护酶系统与抗寒性的关系做了较多的研究，多数报道表明抗寒性强的植物酶活性较高[6]，低温与酶活性显著相关。植物处于低温胁迫时，体内渗透调节物质脯氨酸的含量会显著增加，起到一定的抗寒和自我保护作用[7]。此外，多数植物在逆境条件下往往发生膜脂过氧化，其产物丙二醛(MDA)会严重损伤生物膜。利用MDA含量作为膜脂过氧化指标，可表征逆境条件下细胞膜脂过氧化程度强弱。郭太君等通过测定越冬期山楂等落叶果树枝条的MDA含量证实：随自然温度的下降，MDA含量增加，抗寒性强的品种MDA含量低，抗寒性弱的品种MDA含量高，这一结果与试材电解质外渗率的变化相一致[8]。

项目组在前期调研中发现，三江源区城镇园林树木有30种，隶属11科19属，乡土树种9种，外来树种21种，绿化树种丰富度较低[9]。本研究以三江源区用于城镇绿化的10种乔木为研究对象，选择一年生枝条为研究材料，通过人工模拟低温处理，测定分析其抗寒生理指标的变化趋势。采用隶属函数法综合评价了10种乔木树种的抗寒性，以期为高海拔地区城镇绿化树种的选择提供参考数据。

1 材料方法

1.1 实验材料

供试材料为2019年9月份采集于三江源地区，具体采集地点见表1。对所选植物抗寒性研究的实验于2019年9月-10月进行。采集一年生枝条，石蜡封口，装入自封袋带回实验室后在人工气候条件下进行低温胁迫和生理指标测定。低温处理前，先将离体枝条用自来水冲洗1遍，再用去离子水冲洗3遍，吸干水分。每个树种枝条分成4组，装入自封袋后放置于低温冰箱中进行人工模拟低温胁迫处理。处理设置5℃、-5℃、-15℃、-25℃四个温度梯度，降温速率为5℃/h。达到设定温度后保持24h，将处理组全部放置于5℃冰箱中保存，随后进行相关抗寒生理指标测定。

1.2 电解质渗透率的测定

采用电导率法测定电解质的相对外渗率。将叶片取出后，避开叶脉和叶缘，剪成0.5cm×1cm左右的细条，准确称取0.1g，装入15ml试管中，加入10ml去离子水，充分震荡后于室温下静置4h。使用雷磁DDSJ-308F型电导率仪测定浸提液电导率，记录为R1。将试管煮沸30min，流水冷却至室温后摇匀，再次测定电导率并记录为R2。以相对电导率(REC)表示电解质的相对外渗率，即细胞膜透性的大小。相对电导率的计算公式如下：相对电导率REC(%)=R1/R2×100

1.3 其他生理指标的测定

1.3.1丙二醛含量(MDA)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性测定

称取0.5g叶片并剪成小段，液氮研磨后，加入4.5ml 0.1mmol/L(pH7.0)预冷的磷酸盐缓冲液，充分混匀。将匀浆液转入离心管，4℃6000rpm离心10min。取上清液进行后续测定，每组试验3次重复。POD活性、SDO活性和MDA含量的测定和计算均使用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒进行。

1.3.2 脯氨酸含量测定

称取0.1g叶片并剪成小段，液氮研磨后，加入9倍体积的匀浆介质(南京建成生物工程研究所研制试剂盒提供)。将匀浆液转入离心管，4℃6000rpm离心10min，取上清液使用试剂盒进行测定，每组试验3次重复。

1.4 数据处理

1.4.1 抗寒性综合评价

采用隶属函数法对各项指标进行综合分析，评价树种抗寒性[10]。与抗寒性正相关的脯氨酸含量、SOD活性、CAT活性和POD活性，其隶属函数法计算公式如下：

与抗寒性负相关的电解质渗透率、MDA含量，其隶属函数法计算公式如下：

式中：Xij为i树种j指标的测定值；Xjmin为各树种中j指标的最小值；Xjmax为各树种中j指标的最大值；Rij为i树种j性状的隶属值(0

将每个树种所有指标的隶属函数值累加，求其平均数，数值越大的抗寒性越强。

1.4.2 数据处理与分析

所有试验数据采用SAS统计软件进行显著性分析，使用Origin 8软件进行绘图。

2 结果分析

2.1 低温胁迫对细胞膜透性的影响

如图1所示，5℃条件下，参试树种叶片的相对电导率较低，保持在9.5%-21.4%之间。低温胁迫促进了电解质外渗，尤其是在-25℃条件下，所有参试树种叶片相对电导率均显著高于对照。但不同树种控制电解质外渗的能力存在明显差异，-25℃条件下青海云杉叶片的相对电导率为44.21%，显著低于新疆杨、青杨、小叶杨、白榆、旱柳等阔叶树种，暗示其抗寒能力较强。而经过-25℃处理的新疆杨、青杨、小叶杨叶片的相对电导率均超过90%，表明上述树种在低温条件下调控电解质外渗的能力较弱。参试树种在低温胁迫初期相对电导率增加缓慢，当胁迫温度降低到一定温度时(-25℃或-15℃)，相对电导率急剧上升，随后又趋于平缓，变化呈现“S”型曲线。5个针叶树种，特别是青海云杉低温条件下叶片的相对电导率较低。

图1 低温胁迫下不同树种叶片相对电导率变化

2.2 低温胁迫对叶片MDA含量的影响

如图2所示，低温胁迫显著促进了MDA在10个供试乔木树种叶片中的积累，但不同树种对低温胁迫的响应存在差异。在新疆杨、青杨、小叶杨、青海云杉和落叶松5个树种中，叶片MDA含量随胁迫加剧而增加。说明在上述树种中，叶片MDA含量在一定温度范围内与胁迫程度正相关。在祁连圆柏、白榆、川西云杉和旱柳5个树种中，-5℃或-15℃处理条件下，叶片MDA含量达到峰值，显著高于其余处理。而在油松中，低温胁迫处理对针叶MDA含量的影响不显著。总体上看，油松、祁连圆柏、青海云杉、落叶松、川西云杉5个针叶树种叶片在低温胁迫条件下的MDA含量较低。

图2 低温胁迫下不同树种叶片MDA含量变化

2.3 低温胁迫对叶片SOD活性的影响

如图3所示，在新疆杨、青杨、小叶杨、油松、祁连圆柏、白榆和旱柳7个树种中，-5℃低温胁迫条件下，叶片SOD活性降低。进一步降低处理温度至-15℃后，叶片SOD活性显著提高，说明低温处理可诱导SOD在上述树种叶片中的活性，增强组织响应冷胁迫的能力。在青海云杉、落叶松和川西云杉3个树种中，-5℃低温胁迫即可使叶片SOD活性提高，进一步降低处理温度至-15℃后，SOD活性也随之显著增强，达到峰值。上述结果说明：低温胁迫可增强供试树种叶片SOD活性，不同树种叶片SOD对冷胁迫的响应方式存在差异。

2.4 低温胁迫对叶片POD活性的影响

如图4所示，低温胁迫显著影响了POD在供试树种叶片中的活性。-5℃胁迫使新疆杨、小叶杨、白榆、川西云杉叶片POD活性降低，进一步增加胁迫温度至-15℃或-25℃后，叶片POD活性显著增强，达到峰值。说明低温胁迫可显著诱导POD活性，增强上述树种对冷胁迫的适应能力。在青杨、油松、祁连圆柏、青海云杉、落叶松5个树种中，-5℃、-15℃和-25℃处理均可使POD活性增强，其活性在-15℃或-25℃胁迫条件下达到最高。旱柳叶片POD活性则未发生显著变化。上述结果表明：低温胁迫可使大部分供试树种叶片的POD活性增强，但不同树种的POD活性对冷胁迫的响应存在差异。

图4 低温胁迫下不同树种叶片POD活性变化

2.5 低温胁迫对叶片脯氨酸含量的影响

如图5所示，低温胁迫显著促进了脯氨酸在新疆杨、青杨、小叶杨、油松、祁连圆柏、旱柳、青海云杉、落叶松、川西云杉9个树种叶片中的积累。在大部分供试树种中，叶片脯氨酸含量与胁迫程度存在明显的正相关关系。与上述9个树种不同，白榆叶片脯氨酸含量在低温胁迫条件下显著降低(-15℃处理)，而-5℃及-25℃胁迫处理对其叶片脯氨酸含量的影响不显著。上述结果表明：脯氨酸作为渗透调节物质，可能在植物响应低温胁迫过程中发挥了渗透调节作用，以增强植物响应低温胁迫的能力。

图5 低温胁迫下不同树种叶片脯氨酸含量变化

2.6 抗寒性综合评价

采用单一指标对植物抗寒性进行评价往往存在片面性，基于隶属函数法对多种抗性相关指标进行综合分析，可相对准确的反应植物抗寒的整体表现。本研究使用隶属函数法，对相对电导率、MDA含量、SOD活性、POD活性和脯氨酸含量5个冷胁迫响应相关指标进行了综合分析(表2)，结果显示10个参试树种的抗寒性强弱排序依次为：落叶松>青海云杉>祁连圆柏>川西云杉>油松>白榆>新疆杨>小叶杨>青杨>旱柳。

表2 不同乔木抗寒性的综合评价

3 结论与讨论

植物的抗寒性是与多性状紧密关联的综合表现，因而其评价涉及形态结构、生理变化和基因表达多个层次[11]。在众多的生理指标中，相对电导率通过测定电解质渗漏引发的电导率变化来衡量胁迫引发的细胞膜受损情况，是使用最为广泛的评价指标之一[12]。本研究中，低温胁迫均显著增加了10个参试树种在-25℃胁迫条件下的相对电导率，部分参试阔叶树种的相对电导率已超过90%，说明在强冷胁迫条件下，上述树种的膜系统受损严重，引发细胞内容物大量释放。相较而言，油松、祁连圆柏、青海云杉、落叶松、川西云杉5个针叶树种的相对电导率保持在较低水平，暗示其细胞膜损伤较轻，抗寒性较强。并且本研究中参试树种在低温胁迫初期相对电导率增加缓慢，当胁迫温度降低到一定温度时(-25℃或-15℃)，相对电导率急剧上升，随后又趋于平缓，变化呈现“S”型曲线，这一结果也与崔帅的研究结果相一致[13]。

低温胁迫引发的膜系统损伤可能与胞内氧自由基的积累有关，自由基和活性氧可攻击细胞膜和蛋白，造成膜系统损伤[14]。自由基与膜脂反应的最终产物是丙二醛，因此丙二醛含量常被当作反映细胞膜损伤的一项间接指标用于抗寒性评价。本研究中，低温胁迫条件下油松、祁连圆柏、青海云杉、落叶松、川西云杉5个针叶树种的MDA的积累水平较低，说明低温胁迫对上述树种的细胞膜损伤相对较轻，回应和验证了相对电导率测定的结果和初步结论。

胞内抗氧化酶系统具有清除自由基的作用，可减轻由低温引发的氧化损伤[15]。SOD和POD是最为重要的抗氧化酶类，因而常被选为抗寒性评价的参试指标。在对柑橘[16]和豆梨[6]的抗寒性评价中，不同树种的POD和SOD均呈现先上升后下降的趋势，这一结果与近期发表的关于白杨[17]、冬青[18]、牧草[19]、杏[20]、苹果[21]等植物抗寒性评价研究中的活性变化规律一致。本研究中，随着胁迫程度的加剧，大部分参试树种的SOD和POD活性均呈现典型的先上升后下降趋势，两种酶的活性在-15℃或-25℃条件下达到最高。上述结果表明，大部份参试树种中SOD和POD活性对低温胁迫的响应是保守的。

植物的抗寒性是多基因调控的复杂性状，这决定了其评价必须采用与之相关的复合指标体系进行[11]。目前，采用形态、生理、分子指标的抗寒性评价均已见诸报道[22]，其中以基于相对电导率、丙二醛含量、可溶性糖含量、POD活性、SOD活性、脯氨酸含量等生理指标的评价研究最多，应用最为广泛。通过隶属函数法对抗寒关联指标进行综合，可得到抗寒性的量化结果。使用该方法对本研究中的10个参试树种进行综合分析发现，抗寒性强弱的排序依次为：落叶松>青海云杉>祁连圆柏>川西云杉>油松>白榆>新疆杨>小叶杨>青杨>旱柳。上述结果可为高原耐寒适生树种的选择提供参考和依据。