陈建苗

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 病原生物学系, 北京 100005)

受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases,RTKs)是一种对细胞增殖、分化、细胞周期、胚胎形成、血管生成和新陈代谢等细胞活动的进行具有重要意义的蛋白酶[1-2]。因此,RTKs表达异常会引起多种疾病和肿瘤[3-4]。RTKs胞外区与配体结合，激活RTKs胞内区的激酶活性，使含有Src同源区2(Src homology 2，SH2)和磷酸酪氨酸结合区(phosphotyrosine binding，PTB)结构域的蛋白与胞内区段结合被激活蛋白酶活性[1]。NOK(the novel oncog-ene with kinase-domain,NOK)是一种新型受体酪氨酸激酶。研究发现 NOK具有致癌作用[5]。对多种肿瘤的发生发展以及预后具有重要意义[6-8]。Asp-Phe-Gly(DFG)基序位于激酶活性中心活化环的起始部位，由天冬氨酸残基、苯丙氨酸残基和甘氨酸残基3个氨基酸残基组成，对调节激酶活性具有重要意义[9-11]。然而，研究发现，NOK激酶中没有此结构。于是，本研究拟通过同源配对定点加入DFG基序，以探究DFG-NOK对NIH3T3细胞增殖和细胞周期G1/S的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)；新生牛血清(兰州民海生物工程有限公司)；DMEM培养基(Gibco公司)；Neofect 转染试剂(北京码因科技有限公司)；MTT试剂(Sigma公司)；CCK8试剂(MedChenExpress公司)；Western blot相关试剂和PI染料(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)；PCR引物、pcDNA3.0-DFG-NOK的构建及测序(上海生工公司)；感受态大肠杆菌(天根生化科技有限公司)；限制性内切酶和定点突变试剂盒(TaKaRa公司)；抗β-actin和NOK抗体(Proteintech公司)；抗Akt、p-Akt、 Erk、p-Erk和cyclin D1抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)；抗STAT1抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；抗p-STAT1抗体(Bioworld公司)；抗STAT3和p-STAT3抗体(Cell Signaling公司)；抗JAK3和p-JAK3抗体(Anbo公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养与转染：将NIH3T3细胞置于含有10%新生牛血清DMEM的50 mm培养皿中，于37 ℃，5% CO2培养箱中培养，3 d传代1次。贴壁细胞达到90%汇合后，接种到30 mm培养皿中，24 h后换液。用Neofect高效转染试剂顺时转染NIH3T3细胞，分别转入pcDNA3.0、 pcDNA3.0-NOK和pcDNA3.0-DFG-NOK,转染6 h后换液，48 h后收细胞。

1.2.2 定点突变：突变使用定点突变试剂盒，按说明书操作。

1.2.3 质粒的构建：NOK激酶cDNA全长和HA(人流感病毒血凝素)标签蛋白融合，插入到pcDNA3.0载体的HindⅢ和XbaⅠ位点形成pcDNA-NOK质粒；DFG-NOK和FLAG标签蛋白融合，插入到pcDNA3.0载体的HindⅢ和NotⅠ位点形成pcDNA3.0-DFG-NOK质粒。pcDNA-DFG-NOK质粒的上游引物5′-ATAAGCTTATGGGCATGACACGGATG CT-3′，下游引物5′-ATGCGGCCGCTCACTTATCGT CGTCATCCTTGTAATCAAGCATGCTATAGTTGTAGA-3′。PCR反应扩增30个循环，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min。扩增产物经双酶切再亚克隆进pcDNA3.0载体，在感受态大肠杆菌中转化克隆，提取质粒并对扩增片段进行测序分析。

1.2.4 Western blot检测蛋白表达：收集细胞，裂解液冰上裂解30 min，12 000 r/min离心5 min收取蛋白，BCA工作液紫外分光光度计检测蛋白样品浓度，每孔蛋白上样量15 μg，100 ℃沸水浴5 min。12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离胶电泳，转膜，5%脱脂牛奶37 ℃封闭1 h，一抗按比例用0.5%牛奶稀释后4 ℃孵育过夜，用1×TBST洗4次，每次5 min，37 ℃孵育二抗1 h，清洗，ECL发光液反应，暗室曝光。

1.2.5 CCK8法检测增殖：12孔板培养NIH3T3细胞，转染pcDNA3.0、 pcDNA3.0-NOK或pcDNA3.0-DFG-NOK，再将细胞铺置96孔板，培养48 h后，每孔加5 μL CCK8溶液，孵育1～2 h，酶标仪测定450 nm吸光度值；MTT法：12孔板培养NIH3T3细胞，转染pcDNA3.0、 pcDNA3.0-NOK或pcDNA3.0-DFG-NOK，再将细胞铺置96孔板，培养48 h后，每孔加10 μL MTT溶液，孵育4 h后弃上清，加入150 μL DMSO,在37 ℃摇床上振荡10 min，测定490 nm处吸光度(A)值。

1.2.6 Accuri C6流式检测细胞周期：收集2×106个细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加1 mL预冷的1×PBS重悬，1 000 r/min离心5 min，弃上清；加入0.3 mL预冷1×PBS，再逐滴加入3倍体积的4 ℃预冷的无水乙醇，轻轻振荡成单细胞悬液；-20 ℃固定1 h以上；4 000 r/min离心5 min去乙醇，PBS洗两遍，加100 μL 1×PBS重悬，加100 μL PI染色液避光染色10 min；流式细胞仪检测，保存为FCS文件格式，使用Modfit软件分析细胞周期分布。

1.2.7 同源比对：SWISS MODEL是一种同源建模服务器，根据NOK氨基酸序列同源构建蛋白三级结构，NOK的同源模板为成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)，以FGFR1内DFG基序的位置，确定在NOK加入DFG基序的位置。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 DFG基序加入NOK的位置

根据其DFG基序位置确定NOK中DFG基序位置(图1)。将第269、270位G、L改为D、F，和第271位氨基酸组成DFG基序，对应于NOK cDNA第806、807、810位核苷酸G、A、A突变为A、C、T。

2.2 DFG-NOK对NIH3T3细胞增殖的影响

与瞬时转染pcDNA3.0组相比，瞬时转染pcDNA3.0-DFG-NOK的NIH3T3细胞组吸光度降低，增殖受到抑制(图2A,B)(P<0.05)。

2.3 DFG-NOK对NIH3T3细胞周期G1/S期的影响

与转染pcDNA3.0组相比，转染pcDNA3.0-DFG-NOK组，G1期所占比例升高，S期所占比例降低。DFG-NOK抑制细胞周期G1期进入S期(图3)(P<0.05)。

2.4 DFG-NOK对细胞信号通路和周期蛋白表达的影响

与转染pcDNA3.0组相比，转染pcDNA3.0-DFG-NOK组Erk、STAT1、STAT3和JAK3蛋白的磷酸化水平(图4A～C,E～H) 以及细胞周期蛋白cyclinD1表达水平均降低(图4D, I)。

3 讨论

NOK是一种新型受体酪氨酸激酶，包含422个氨基酸，镶嵌在细胞膜上，具有完整的胞内区、跨膜区和远小于其他受体酪氨酸激酶胞外区段的胞外区[5]，它参与多种信号通路的激活，比如RAS-MAPK、PI3K-AKT和JAK-STAT等信号通路[12]。NOK在不同物种或组织器官中异常表达，人体内前列腺中的NOK表达量最高，小鼠体内小肠和结肠中表达量最高。293T和HeLa等细胞系中的NOK表达高于其他细胞系[5]。NOK在胶质瘤和鼻咽癌中激活PI3K-AKT信号通路[7-8]。此外，NOK对细胞周期也有重要作用，研究证明NOK可促进293T cyclin D1表达和细胞周期G1期进入S期[13]。

DFG分为两种构像DFG-in和DFG-on，存在于Src和P38等激酶中，对激酶活性起到重要作用[9-11]。比对NOK氨基酸序列发现其没有DFG基序。至今没有关于DFG基序和NOK激酶相关联的研究。基于以上科研背景，展开此项关于DFG-NOK的研究。

本研究选择NIH3T3细胞为研究对象，展开DFG-NOK对细胞信号通路、细胞周期及细胞增殖影响的研究。实验发现，NOK加入DFG基序后抑制增殖信号通路Erk、STAT3、JAK3的磷酸化和周期蛋白cyclin D1的表达；同时，也抑制NIH3T3细胞增殖和细胞周期由G1期进入S期。因此，推论NIH3T3细胞增殖的抑制可能是由于p-Erk、p-STAT3和p-JAK3表达下降引起的；细胞周期G1期进入S期阻滞可能是周期蛋白cyclin D1表达水平下降引起的，而G1期进入S期的抑制也引起细胞增殖的抑制。STAT1是细胞凋亡相关信号通路，对于结果中pcDNA3.0-DFG-NOK抑制p-STAT1表达原因还不清楚，需进一步对NIH3T3细胞进行凋亡检测。DFG-NOK中GLG突变为DFG,甘氨酸突变为天冬氨酸，非极性氨基酸变为酸性氨基酸，亮氨酸突变为苯丙氨酸，非极性氨基酸变为芳香族氨基酸，氨基酸性质的改变，致使各氨基酸残基之间的空间构象和相互作用力改变。

A.Accuri C6 result of NIH3T3 transiently transfected pcDNA3.0；B.Accuri C6 result of NIH3T3 transiently transfected pcDNA3.0-DFG-NOK；C.statistics analysis of the G1/S phase distribution; *P<0.05 compared with pcDNA3.0

A.changes of Akt,p-Akt、Erk,p-Erk protein expression in responding to DFG-NOK over expression； B.changes of STAT1,p-STAT1,STAT3,p-STAT3 protein expression in responding to DFG-OK over expression；C.changes of JAK3,p-JAK3 protein expression in responding to DFG-NOK over expression；D.changes of cyclinD1 protein expression in responding to DFG-NOK over expression；E.gray-scale value of p-Erk in responding to DFG-NOK over expression；F.gray-scale value of p-STAT1 in responding to DFG-NOK over expression；G.gray-scale value of p-STAT1 in responding to DFG-NOK over expression； H.gray-scale value of p-STAT1 in responding to DFG-NOK over expression； I.gray-scale value of p-STAT1 in responding to DFG-NOK over expression； *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 compared with pcDNA3.0 group； #P<0.05 compared with pcDNA3.0-NOK group

本工作虽然证实DFG-NOK抑制NIH3T3细胞增殖和细胞周期G1期进入S期。但对于DFG-NOK的结构和引起这些作用的机制还未明确，需做进一步研究。