尤鹏升，韦 晖，许 琪

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 生物化学与分子生物学系医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)

精神分裂症(schizophrenia)是一种高异质性的重症精神疾病。流行病学结果显示，精神分裂症多发于青春期晚期或成年早期，人群终生患病率约为1%[1]，男女患病率基本相同，但男性患者普遍发病年龄较早，症状更加严重。

The first hit was composed of maternal immune activation by poly I:C on gestation day 9.5; control mother received corresponding vehicle solution; offspring born to Poly I:C-treated(MIA) or vehicle-treated(CON) mothers were weaned on postnatal day 21; then they were exposed to poly I:C or saline on gestation 21 or 42 as the second hit; behavioral assessment took place when the animals reached postnatal day 56

精神分裂症的神经发育假说认为，生命早期的大脑发育缺陷积累是该疾病的重要病因学基础之一[2]。流行病学研究发现，母体妊娠期间感染风疹、弓形虫、流感病毒等会增加子代精神分裂症的发病风险[3]。在妊娠中期向母鼠注射聚肌胞苷酸(polyinosinin-polycytidylic acid, polyⅠ:C)或脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，模拟病毒感染的炎性反应，子代成年后表现出精神分裂症样的表型[4]。青春期也是神经发育的关键节点，青春期的不良事件是精神分裂症的高危风险因素之一。基于流行病学、精神分裂症复杂的遗传学以及延迟发病的现象，有人提出精神分裂症的“二次打击”假说[5]，认为产前感染和产后应激具有累积效应，也就是说围产期感染使发育中的大脑对青春期的不良事件更为敏感，增加了大脑的脆弱性[6]，从而增加子代患精神分裂症的风险。本研究旨在探究孕期感染和产后炎性反应对精神分裂症的发生是否具有协同效应。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：SPF级成年C57BL/6J雄鼠10只，雌鼠20只，体质量20～25 g，购买于斯贝福(北京)生物技术有限公司(合格证号:110324200102749567、110324200102750947)在中国医学科学院动物中心饲养。饲养标准为5只/笼，温度区间为20 ℃～24 ℃，湿度区间为50%～70%，光照时间为8∶00～20∶00，自由饮水摄食。

1.1.2 主要试剂：polyinosinin-polycytidylic acid和地佐环平(Sigma-Aldrich公司)；Mouse IL-6、IL-10和TNF-α试剂盒(R&D公司)；FastStart Essential DNA Green Master(Roche公司)；Trizol(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 “二次打击”模型的建立(图1)：9周龄雌鼠与雄鼠2∶1合笼过夜，次日取出雄鼠，雌鼠记为GD 0.5。孕鼠于GD 9.5[7]时随机分成两组，按照10 mg/kg单次腹腔注射poly I:C或0.9%氯化钠溶液，子代小鼠分别为母体免疫激活(maternal immune activation, MIA)小鼠和对照小鼠。子代小鼠生长至3周时雌雄分笼，分别于3周(龄)、6周(龄)时第2次注射poly I:C(10 mg/kg)或0.9%氯化钠溶液。小鼠正常饲养至8周行为学检测。

1.2.2 ELISA检测炎性因子: 小鼠注射poly I:C或0.9%氯化钠溶液，分别在注射后3、12、24 h共3个时间点取血静置，离心后吸取上层无色透明血清，于-20 ℃保存备用。参照ELISA检测说明书进行抗体包被、标准品及样品检测，利用分光光度计在波长450 nm以及540 nm处记录吸光度值，制作标准浓度曲线，计算血清中IL-6、IL-10以及TNF-α的浓度。

1.2.3 RNA提取与基因表达量的检测：取新鲜海马和皮层组织，利用Trizol匀浆和氯仿分层法分离RNA。用cDNA反转录试剂盒将600 ng RNA反转录成cDNA进行RT-qPCR检测。

1.2.4 行为学检测: 前脉冲抑制(prepulse inhibition, PPI)和MK-801诱导的自发活动是精神分裂症模型评定的重要指标。PPI：在25 min的测试过程中，实验动物接受惊反射刺激、前脉冲刺激、前脉冲联合惊反射刺激以及恒定背景噪声(65 dB)的无刺激实验4种类型。惊反射刺激为120 dB，持续40 ms的白噪声；前脉冲刺激为70、75、80以及85 dB的白噪声。实验开始后，给予每只动物5 min的适应时间，之后每种类型的实验以假随机的顺序出现8次，每个实验间的间隔为15～25 ms。

MK-801诱导的自发活动：将实验小鼠放在矿场检测箱(40 cm×40 cm×35 cm)，追踪30 min内小鼠的自发活动轨迹。取出小鼠，按5 mg/kg的剂量腹腔注射MK-801(0.025 μg/mL)后放回检测箱，追踪60 min内小鼠的活动轨迹。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 poly I:C诱导中枢及系统炎性反应

注射poly I:C能够诱导机体产生强烈的系统及中枢炎性反应(图2)。注射后3 h血清中IL-6、IL-10以及TNF-α均显著升高(P<0.001)，12 h后细胞因子的水平基本恢复正常，24 h后血清中的细胞因子水平完全恢复正常(图2A～C)，炎性反应消失。脑组织中IL-6和IL-1β的mRNA表达水平在poly I:C注射3 h后两种细胞因子的mRNA表达水平均显著上升，12 h后基本恢复正常水平，与血清中的变化趋势相同(图2D～H)。在海马组织中，IL-6和IL-1β的mRNA表达水平分别为对照组的3.5倍和3.4倍(图2D，E)；在皮层中，IL-6的mRNA表达水平为对照组的6.6倍(图2G)，而IL-1β没有显著变化(图2H)。大脑中TNF-α mRNA表达水平在poly I:C注射12 h之内一直处于升高的状态，直到24 h后才恢复正常(图2F, I)。

Pregnant mice were exposed to poly I:C or control vehicle(saline) solution on gestation 9.5, and the inflammatory cytokines in plasma(A-C), inflammatory mRNA transcripts in hippocampus(D-F) and cerebral cortex(G-I) were measured 3，12 and 24 hours post-treatment；plasma: A.IL-6; B.IL-10; C.TNF-α; hippocampus: D.IL-6; E.IL-1β; F.TNF-α; cerebral cortex: G.IL-6, H.IL-1β,I.TNF-α; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with control group

2.2 MIA组中雌性比雄性表现出更强的精神分裂症表型

MIA组小鼠在前脉冲声强为75、80以及85 dB时，惊反射抑制率较对照组显著降低(图3A,B)。MIA组小鼠注射MK-801后自发活动较对照组明显增加，雄鼠在80、85以及90 min时显著升高；雌鼠在55～90 min内运动水平显著升高(图3C,D)。

在4种不同的前脉冲声强刺激下，雄性对照组小鼠的惊反射抑制率较雌性小鼠没有明显差异，但在前脉冲声强为80、85 dB时，MIA组雌性小鼠的前脉冲抑制率较雄性小鼠显著降低(图3A)。MK-801的结果也发现，对照组注射MK-801后，雌性小鼠和雄性小鼠间自发活动没有明显差异，但是MIA组小鼠60～75 min时，雌性小鼠的自发活动明显高于雄性小鼠(图3C)。

A.sensorimotor gating as assessed by PPI of the acoustic startle reflex; PPI as a function of increasing prepulse intensities(dB above background of 65 dB)； *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with male control(saline-saline)； #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 compared with female control(saline-saline); B.startle amplitude in 120 dB; C.locomotor reaction to the non-competitive NMDAR receptor antagonist dizocilpine； the line plot showed the distance moved in an open field arena to initial non treatment and subsequent MK-801 treatment as a function of successive 5-min bins； #P<0.05 reflecting the significant difference between male and female group; D.mean distance moved in the open field after administration of MK-801

2.3 poly I:C的“二次打击”减弱MIA小鼠的精神分裂症表型

在雄性小鼠中，MIA组小鼠前脉冲抑制率明显降低，青春期单次注射poly I:C的小鼠在前脉冲声强为80、85 dB时，其惊反射抑制率较对照组也显著降低(图4A)，而成年早期注射Poly I:C的雄鼠则无明显变化(图4B)。产前感染联合青春期炎性的“二次打击”之后，小鼠的前脉冲抑制率与对照组相比反而没有明显变化(图4A,B)。雌性小鼠的实验结果与雄性小鼠基本一致，MIA组小鼠以及青春期感染的小鼠在前脉冲声强为75、80 dB时，其惊反射抑制率较对照组均具有显著差异(图4C)。当青春期受到“二次打击”后，小鼠在70、85 dB处的惊反射抑制率较对照组显著降低(图4C)。成年早期的“二次打击”使小鼠在70、80、85 dB时的惊反射抑制率显著下降(图4D)，但也没有孕期感染单次打击造成的表型明显。

Sensorimotor gating as assessed by PPI of the acoustic startle reflex; PPI as a function of increasing prepulse intensities(dB above background of 65 dB); the effects of single or combined exposure to prenatal immune activation and prepubertal inflammation or early adulthood inflammation on sensorimotor gating in male or female mice; A.prepubertal inflammation in male; B.early adulthood inflammation in male; C.prepubertal inflammation in female; D.early adulthood inflammation in female; *P<0.05, **P<0.01 compared with saline-saline group

3 讨论

流行病学和动物模型表明孕期感染和青春期的不良事件均是精神分裂症的高危风险因素[8]。本实验通过单次或两次注射poly I:C建立精神分裂症的“二次打击”小鼠模型，发现孕期感染和青春期或成年早期炎性的联合打击并不能加剧小鼠精神分裂症的表型，反而有一定的缓解作用，表明两者间不存在累加效应。

类似的现象也有报道，青春期单只饲养的小鼠会表现出过度活跃、海马和皮层细胞因子水平升高、记忆和学习功能受损等表型，而妊娠期注射poly I:C再单只饲养的小鼠非但没有加重上述表型，反而缓解了因为隔离而产生的一系列行为和细胞因子变化[9]。此外，通过产前免疫应激(妊娠第9天单次注射poly I:C)联合青春期压力应激(电足、束缚、水剥夺以及重复更换笼具)建立精神分裂症的“二次打击”模型，发现孕期感染增加了子代对压力应激变化的脆弱性，也就是说母体免疫激活与青春期压力应激会产生协同的病理效应[7]。同时也有研究发现青春期的压力应激并不能加剧孕期感染造成的行为变化[10]。“二次打击”的研究结果如此大相径庭，究其原因可能是由于孕期感染的时间、剂量以及第二次打击的方式不同造成的。现有研究中，孕期感染的时间从GD 9-17不等，部分研究采用多种社会压力应激作为二次打击，包括隔离饲养、电足、束缚等不良事件，而另一部分研究采用炎性应激，包括注射poly I:C或LPS[11]。

本研究通过围产期和青春期poly I:C的注射建立精神分裂症的小鼠模型，明确母体免疫激活的小鼠较“二次打击”的小鼠具有更明显且稳定的行为学改变。相较于“二次打击”模型的不确定性，母体免疫激活的子代动物能够稳定的表现出精神分裂症的核心症状[12]：感觉运动门控障碍、焦虑增加以及MK-801的敏感性增强，而且这些行为改变多数可以通过抗精神病药物得到减轻，如氯氮平、奥氮平等。因此，母体免疫激活模型依然是研究精神分裂症的发病机制、新药筛选的首选模型。