杨旭东，于红亮，李 静，赵春华

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 细胞生物学系，北京 100005)

结直肠癌(colorectal cancer)是最常见的恶性肿瘤之一，约占全世界每年诊断的癌症和癌症相关死亡的10%，在发展中国家的发病率和病死率呈上升趋势[1-2]。外泌体是几乎所有细胞都能分泌的直径30～200 nm的双层膜囊泡，含有蛋白、DNA、RNA、脂质等多种成分，具有生物学功能[3]。随着近些年的不断研究，外泌体显示出了在多方面的功能和应用，比如减缓衰老，治疗少肌症和阿尔茨海默病[4-6]。

近年来，巨噬细胞外泌体对肿瘤作用的研究也在逐渐增加。通常，M1型巨噬细胞的外泌体具有促炎和抑制肿瘤生长的作用，如能增强疫苗的抗肿瘤活性[7]，增强紫杉醇抗肿瘤的效果[8]，而M2型巨噬细胞的外泌体却是抑炎和促进肿瘤生长的[9-10]。J774A.1细胞是小鼠单核巨噬细胞，有研究证明其表型为M2型[11-12]，目前该细胞及其外泌体对结直肠癌影响及相关机制的报导较少。本研究使用J774A.1的外泌体处理结直肠癌细胞MC38和CT26，观察它们的增殖、迁移能力及MEK-ERK通路磷酸化水平的变化，初步探索J774A.1的外泌体在结直肠癌中的作用，以期为人结直肠癌的治疗提供一定的借鉴意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂和耗材：DMEM高糖、RPMI 1640 和胎牛血清(Gibco公司)；青霉素和链霉素(PS)(华北制药股份有限公司)；0.22 μm滤杯和100 KD超滤管(Millipore公司)；流式抗体CD68和CD206(Proteintech公司)；多聚甲醛(国药集团化学试剂有限公司)；CCK8试剂盒(Yeasen公司)；Western blot抗体CD63(Proteintech公司), TSG101和CD9(Abcam公司), MEK、p-MEK、ERK和p-ERK(Cell Signaling Technology公司)。

1.1.2 细胞：小鼠巨噬细胞J774A.1及小鼠结直肠癌细胞系MC38和CT26均购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：J774A.1细胞用DMEM高糖+10% FBS+PS培养，MC38细胞和CT26细胞用RPMI 1640+10% FBS+PS培养。

1.2.2 J774A.1细胞表型的鉴定：将J774A.1细胞用细胞刮收集，用D-Hank’s缓冲液清洗后于4 ℃孵育一抗30 min，清洗后于4 ℃孵育二抗30 min，清洗后筛网过滤，流式检测CD68和CD206。

1.2.3 超滤法提取外泌体：当J774A.1细胞汇合度达到80%时，换无血清培养基培养48 h。收集上清至50 mL离心管，2 500 r/min离心30 min去除细胞碎片等杂质。离心后的上清用0.22 μm的滤杯在超净工作台中过滤，之后再用100 KD超滤管在4 ℃超速离心机中离心以提取外泌体，离心转速从4 000×g逐渐上升到6 000×g，离心时间从5 min逐渐上调到20 min。

1.2.4 透射电镜鉴定外泌体：1%戊二醛固定外泌体，滴20 μL在铜网上，滴加1%乙酸双氧铀负染2 min，滤纸吸除多余染液，日光灯下干燥1 h后拍照。

1.2.5 结直肠癌细胞对外泌体的摄取：将1 μL 浓度为1 mmol/L的荧光染料DiI加入1 mL含外泌体的RPMI 1640溶液中，将适量混合液加入细胞培养板中，在不同时间段(0、6、12、24 h)对细胞使用多聚甲醛固定，清洗后加入1 μL Hoechst染料染色，清洗后加入1 mL缓冲液，拍照。

1.2.6 CCK8检测细胞增殖：将MC38和CT26细胞分别按2 000个/孔接种于96孔板，第1～3天内检测，加入10% CCK8培养1 h，用酶标仪在450 nm处检测吸光度值。按CCK8试剂盒说明书计算细胞增殖率。

1.2.7 细胞划痕实验检测细胞迁移能力：将细胞按5.0×105个/孔接种于6孔板，当细胞汇合至90%时，用10 μL的枪头进行划痕，用缓冲液清洗3次。外泌体浓度为300 μg/mL，在不同时间点(如0、12、18、24、36 h)显微镜下进行观察和拍照。

1.2.8 Western blot检测蛋白：将细胞按2×105个/孔接种于6孔板，过夜换新鲜培养基且添加外泌体，外泌体浓度为300 μg/mL，处理24 h后提取细胞总蛋白用于Western blot实验，检测MEK-ERK信号通路。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 J774A.1细胞表型及其外泌体的鉴定

小鼠单核巨噬细胞J774A.1贴壁生长,流式细胞术检测其表型为CD68+CD206+(图1A)，说明其为M2型巨噬细胞。按照超滤的方法提取J774A.1细胞的外泌体。透射电镜观察到外膜深染的圆形或类圆形的微囊泡，直径为30～140 nm(图1B)。纳米颗粒追踪分析NTA显示囊泡的直径分布范围，峰值在126.6 nm处(图1C)。Western blot实验表明这些微囊泡阳性表达外泌体的标志蛋白TSG101、CD63和CD9(图1D)。以上结果符合外泌体的基本特征。

A.flow cytometry was used to identify the phenotype of J774A.1； B.transmission electron microscopy was used to detect the morphology of J774A.1 exosome； C.NTA was used to assess the diameter size of J774A.1 exosome； D.Western blot was used to detect the surface markers of J774A.1 exosome

2.2 结直肠癌细胞MC38和CT26摄取J774A.1的外泌体

分别在0、6、12和24 h对细胞进行免疫荧光观察的结果显示，随着时间的延长，MC38和CT26对外泌体的摄取量逐渐增加，24 h时达到高峰(图2)。

图2 MC38及CT26摄取J774A.1外泌体Fig 2 Uptake of J774A.1 exosome by MC38 and CT26

2.3 J774A.1细胞的外泌体促进MC38和CT26细胞增殖

CCK8法检测结果显示，用不同浓度外泌体处理24～72 h后，相比于MC38细胞的对照组，外泌体的所有浓度处理组的细胞增殖均显著增加(P<0.05)，且存在一定的浓度和时间依赖性(图3)。而相比于CT26细胞的对照组，外泌体的高浓度处理组(50～300)μg/mL的细胞增殖也都明显增加(P<0.05)，并且呈一定的浓度和时间依赖性(图3)。

*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with 0 μg/mL group图3 CCK8法检测MC38和CT26的增殖能力Fig 3 Proliferation of MC38 and CT26 was detected by CCK8

2.4 J774A.1细胞的外泌体促进MC38及CT26细胞的迁移能力

无血清培养基培养条件下，随着时间的增加，与对照组相比，加入外泌体的实验组MC38细胞和CT26细胞的迁移率均明显增加(图4)。

图4 划痕愈合实验检测MC38和CT26的迁移能力Fig 4 Migration ability of MC38 and CT26 was detected by wound healing assay

2.5 J774A.1细胞的外泌体对增殖迁移相关信号通路的影响

Western blot检测增殖迁移相关的MEK-ERK信号通路的结果显示，p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达水平升高(图5)。

图5 蛋白印迹法检测MC38和CT26中MEK-ERK信号通路的活化情况Fig 5 The activation of MEK-ERK signaling pathway in MC38 and CT26 was detected by Western blot

3 讨论

恶性肿瘤具有无限增殖、抗凋亡、促进炎性反应、向组织侵袭和转移等能力，其并发症所带来的危害会造成患者身心的巨大痛苦和医疗费用上的沉重负担，所以肿瘤治疗具有非常重要的意义。肿瘤组织由肿瘤细胞及其赖以生存的肿瘤微环境组成，肿瘤微环境含有免疫细胞在内的细胞成分、细胞外基质和细胞因子等。外泌体也属于肿瘤微环境，参与肿瘤的发生发展[13]。

结直肠癌是威胁人类健康和生命的一大恶性肿瘤，具有相当高的发病率和病死率。本研究探讨了小鼠巨噬细胞J774A.1分泌的外泌体对结直肠癌细胞系MC38和CT26的影响，实验结果提示增殖迁移能力的增强在机制上可能是通过激活MEK-ERK信号通路实现的。通常情况下，外泌体可以通过microRNA或蛋白等成分作用于信号通路，从而发挥生物学功能[10,13]。所以值得进一步研究的是，J774A.1外泌体是通过何种分子成分活化的此通路。经过文献检索，M2型巨噬细胞的外泌体对结直肠癌、胃癌、肝癌、胰腺导管癌、胶质瘤、膀胱癌、卵巢癌和乳腺癌有促进作用。MEK-ERK是肿瘤细胞增殖迁移的一条常见通路，但是迄今未发现M2型巨噬细胞的外泌体通过此通路促进肿瘤发生发展的报导。此外，有研究表明，M2型巨噬细胞外泌体可通过PI3K-AKT通路促进肿瘤发生发展[14]。实际上，肿瘤和巨噬细胞之间的作用是相互的，肿瘤的外泌体也能对巨噬细胞产生非常重要的影响[15]。比如，结直肠癌的外泌体能够诱导巨噬细胞向M2型极化，而极化的巨噬细胞能促进上皮间质转化和分泌生长因子、趋化因子等,促进癌症的发展与转移[14,16]。

随着研究的深入，相信外泌体的结构和组分会得到不断的解析，在外泌体表面的分子修饰及其内部成分的可控变化，将使外泌体在疾病治疗上的作用得到极大的进步。而且巨噬细胞与肿瘤关系密切，二者之间的作用也许能帮助我们较好地理解巨噬细胞外泌体的功能及其在肿瘤治疗中的应用。综上所述，M2型巨噬细胞J774A.1的外泌体有望成为结直肠癌上分子靶向治疗研究的一个新工具。