李 丽，陈 菲，包春娟，周琪琪，包 骥

抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphase, TRAP)是破骨细胞的特异性标志酶，TRAP染色显示破骨细胞胞质中TRAP的活性，是破骨细胞的特异性染色[1]。本文首次采用TRAP染色与免疫组化套染技术，帮助研究者实现在同一张脱钙骨组织石蜡切片上观察破骨细胞与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)共表达情况，该套染技术在国内外尚未见报道。脱钙骨组织制片比软组织制片过程繁琐且易出现脱片、染色背景深等问题，作者经反复摸索优化实验步骤，现将该套染技术介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料(1)样本制片：兔股骨髁骨缺损处填充直径为7 mm的羟基磷灰石生物材料，造模后于不同时间点取材，离体骨组织立即用10%中性缓冲福尔马林固定，固定后用硬组织切片机将兔股骨切成3 mm厚薄片再继续固定48 h，用改良EDTA脱钙液脱钙[2]，脱钙液置于37 ℃水浴锅，每2天更换1次脱钙液。待骨组织脱钙完全后行常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片，其中1片行常规HE染色。(2)试剂：TRAP染色试剂盒购自德国Sigma-Aldrich(387A-1KT)；Rabbit anti-VEGF抗体(1 ∶100，Abcam公司，货号ab28775)；抗体稀释液(DAKO公司，货号：S2022)；Wash Buffer(DAKO公司，货号DM831)；免疫组化试剂盒REAL EnVision(DAKO公司，K5007)；苏木精染液(Thermo公司，货号7211)。(3)耗材：Super PAP Pen超级免疫组化油笔(福州迈新公司，货号PEN-0002)。(4)大型设备：硬组织切片机(西安蓝茗医疗科技公司)；全自动封片仪(Thermo，ClearVue)；WSI全数字切片扫描仪(3DHISTECH，Pannoramic SCAN)。

1.2 方法

1.2.1TRAP染色 (1)石蜡切片常规脱蜡至流水冲洗；(2)双蒸水充分洗涤后，将装有待染切片的双蒸水染色盒放入37 ℃水浴锅中静置15 min；(3)按照TRAP染色试剂盒说明书配制TRAP孵育液，即用即配；(4)将待染切片放入37 ℃ TRAP孵育液内避光浸染60 min；……