◎ 张洺榛，廖小丽

（1.湖北江晓环保科技有限公司，湖北 武汉 430000；2.武汉海关技术中心，湖北 武汉 430000）

油茶作为21世纪重要的木本油料作物之一，近年来一直被作为研究热点为广大学者所热衷。油茶的主要利用部分为油茶果，油茶果主要由油茶外壳、油茶籽壳、油茶籽仁三大组分构成[1]，其中，油茶籽仁除含有大量的不饱和脂肪酸外，蛋白质、糖类、茶皂素等也是其主要成分，同时油茶籽仁还含有植物甾醇、角鲨烯等微量活性成分。在这些组分当中，茶皂素又是其中的热点。茶皂素又被称为茶皂苷，熔点约224 ℃，平均分子式为C57H90O26，相对分子质量为1 200～2 800，是一种天然的糖苷化合物[2]，同时也具备这一类物质的通性——易溶于乙醇和甲醇，但是难溶于无水甲醇和无水乙醇，不溶于石油醚、苯等有机试剂。由于其具备抗菌、抗病毒、降血脂等诸多优势，茶皂素被广泛地应用于医美、食品等领域[3]。

油茶是我国的特色植物，在国外的种植较为稀少，所以国外学者对于油茶及其相关物质的研究不多[4]。而国内学者提取茶皂素的方法主要分为水提法和醇提法两种，经有关学者试验得知，水提法提出来的茶皂素相对于醇提法来说杂质多一些，但是水提法相对成本低廉，所以这两种方法在实际的工业生产当中都有所应用[5]。本文采用80%热乙醇溶液（75 ℃）进行浸提，为了保证其得率，采用复提取的方法进行提取。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品采用湖南衡阳产地晒干带壳茶籽。茶皂素分析标准品（纯度≥98%，阿拉丁）。无水乙醇（AR）、硫酸（1.86 g·mL-1）、香草醛（AR）、石油醚（30～60 ℃，AR），试剂均为上海国药集团生产；纯水（满足实验室三级水及以上），实验室常用材料及耗材。

1.2 仪器与设备

E7221型紫外-可见分光度计及其配套器材；me2041型电子天平（感量为0.000 1 g）；HH-S1型恒温水浴锅；101-4B型鼓风干燥机；HU10300/40B型超声清洗机；2500型粉碎机。

1.3 溶液配制

80%乙醇溶液（V/V）：4份无水乙醇加1份纯水，充分混匀；1 mg·mL-1茶皂素标准溶液：准确称取100 mg样品，用80%乙醇溶液溶解并定容至100 mL；77%硫酸溶液（V/V）：将77.00 mL硫酸（1.86 g·mL-1）用玻璃棒缓慢引流至盛有23.00 mL纯水的200 mL烧杯中；8%香草醛溶液（W/V）：将4 g香草醛固体溶于50.00 mL的80%乙醇溶液中。

1.4 样品预处理

1.4.1 去壳处理

将200 g左右茶籽装在网袋中用木锤进行捶打，使油茶籽壳与油茶籽仁分离，然后挑选出茶籽仁。在这个过程中需要将所有茶籽分离，保证样品的均一性，同时在捶打过程中应当严格控制好力度，防止样品破碎导致出油率过高出现黏连等现象，引入过大的误差。

1.4.2 粉碎

将步骤1.4.1中分离的油茶籽仁放入粉碎机中粉碎，粉碎后过20目筛，样品过筛率要达到95%以上且不可以强行过筛，过筛完后将样品混匀，装袋备用。

1.4.3 含水率测定

通过重量法进行含水率测定，在烘干、干燥、恒重后的铝盒中加入步骤1.4.2中样品（10.0±0.1）g，盖上铝盒放入烘箱烘干至恒重，以上遵循国家标准《食品安全国家标准 食品中水分的测定》（GB 5009.3—2016）。该步骤是为了能够校正后面测定样品的实际质量，从而使结果误差有效降低。

1.4.4 索氏提取

以石油醚做提取剂用感量为0.000 1 g的电子天平称取步骤1.4.2中样品（1.00±0.01）g，按照索氏提取的操作规程用滤纸将样品包起来，折成适宜大小放入虹吸管进行索氏提取，时间为6 h。该步骤是为了充分将油清除，防止后面在显色时干扰实验结果。

1.4.5 干燥

将索氏提取完成后的滤纸包取出，放入鼓风干燥机中（70±2）℃恒温烘干30 min，将残留的石油醚蒸发耗尽。

1.4.6 乙醇提取

将干燥后的滤纸包放入100 mL的锥形瓶中，加入50 mL的80%乙醇溶液，封上封口膜，在75 ℃的条件下恒温水浴提取2 h，其间超声3～5次，到时间后将烧瓶中的残余液直接转移至250 mL容量瓶中，并用80%乙醇溶液清洗几遍，清洗滤液也转移至同一个250 mL容量瓶中。重复以上步骤进行乙醇复提取。

1.4.7 转移、定容

将两次提取液最终都放置在一起，并按照定容相关操作用80%乙醇溶液定容至刻度线。期间，定容至250 mL容量瓶约2/3处进行充分摇匀，定容结束后盖上玻璃塞进行上下摇匀，再将玻璃塞旋转180°后再度摇匀，确保溶液的均一性。

1.5 实验方法

1.5.1 上机前

用移液管准确吸取1 mL步骤1.5.7中定容后的溶液至玻璃试管中，加入0.5 mL的8%香草醛溶液，再加入5 mL的77%的浓硫酸溶液，充分混匀后60 ℃水浴15 min，紧接着冰水浴10 min。

1.5.2 上机测试

将步骤1.5.1中冰水浴后的样品用紫外-可见分光光度计在533 nm进行测试，记录下吸光度A。

2 结果与分析

2.1 提取次数确定

在本次实验中，提取率与提取次数的关系如表1所示。

表1 油茶中茶皂素提取率与提取次数的关系表

假设在第4次茶皂苷提取完全，在第1～3次的相对得率分别为76.56%、94.36%、97.32%，出于绿色化学理念和实验成本等多方面进行综合考量，提取2次是最佳实验方案。

2.2 标准曲线的制作与确定

选取6支玻璃试管，编号1、2、3、4、5和6，用移液管分别准确吸取0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL的1 mg·mL-1的茶皂素标准溶液，分别加入80%乙醇溶液0.8 mL、0.6 mL、0.4 mL、0.2 mL、0.0 mL；再分别加入0.5 mL的8%香草醛溶液，然后再加入5 mL的77%的浓硫酸溶液，充分混匀后60 ℃水浴15 min，紧接着冰水浴10 min。

最大吸收波长的选择：将2、4、6号管的溶液在400～780 nm，间隔1 nm区间进行光谱扫描，最终确定533 nm为最大吸收波长，即实验测定波长。

按照以上操作，以吸光度为纵坐标，以茶皂素浓度为横坐标，绘制标准曲线如图1所示，回归方程为y=0.796 7x-0.004 2，相关系数R2=0.999 6。

图1 茶皂素标准曲线图

2.3 油茶籽仁中茶皂素含量测定

测得样品浓度分别为16.05%、16.18%、16.14%，平均浓度为16.12%。经过测定，茶籽含水率为5.73%，则茶皂素的实际浓度为17.10%。

2.4 精密度试验

经过计算，相关数据相对平均偏差为0.33%，符合化学分析相关要求，即数据证明有效。

2.5 加标回收率

重新选择6根玻璃试管，分别加入0.0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL样品，再分别加入0.1 mL的1 mg·mL-1茶皂素标准溶液，用80%乙醇溶液补到1 mL，再加入0.5 mL的8%香草醛溶液，然后再加入5 mL的77%的浓硫酸溶液，充分混匀后60 ℃水浴15 min，紧接着冰水浴10 min。经测定，该方法的加标回收率为95.8%～101.3%如表2所示，符合化学分析相关要求，即数据证明有效。

表2 加标回收率测试原始数据表

3 结论

通过香草醛-浓硫酸法测定茶皂素含量，虽然在整个过程中会受到油脂的干扰以及反应时间的影响，但是相对于HPLC测定茶皂素来说，此方法更为便捷、消耗时间也更少，不需要进行过多的操作，为后续的类似实验处理提供了便捷途径。

本方法各项指标均符合化学分析的相关要求，但由于实验影响因素较多，所以导致部分细节方面有待商榷，在后续的实验中，应该更加注重一些细节性的问题，使油茶果中茶皂素的提取和测定更加精确。同时，由于茶皂素物质组成较为复杂，导致该实验不一定是最佳的测试条件，这也是茶皂素目前为止没有制定统一标准的原因之一。对于茶皂素测定的进一步规范化，还有待其他学者的进一步深入研学，从而找到一个公认的优良方法。