郑亚萍, 余涵霞, 张昕宇, 欧巧菁, 岳茂峰, 李伟华*

1华南师范大学生命科学学院，广东省植物发育生物工程重点实验室，广东 广州 510631; 2广东石油化工学院生物与食品工程学院，广东 茂名 525000

化感作用在外来植物入侵过程中扮演着重要作用(万方浩等, 2015)。当入侵植物进入由土著植物占优势的新生境时，入侵植物会通过释放难以被本地种适应的新奇化感物质来抑制本地植物的生长，从而实现定植成功并进一步扩张，这一理论被称为“新武器假说”(Callaway & Aschehoug,2000; Callaway & Ridenour,2004)。研究表明，大多数入侵植物具有较强的化感作用(姜朝阳等,2020; 李富荣等,2011; Callaway & Aschehoug,2000; Callaway & Ridenour,2004)。其化感物质存在于各种植物组织中，如叶、花、果、茎、根、种子和花粉等(Tang & Putnam,1986)。通常，植物在生长发育过程中，通过茎叶挥发、浸出和根系分泌将化感物质释放到环境中(Ismail & Nornasuha,2014)，再通过雨水和雾滴等淋溶作用进入土壤，直接或间接地影响其他植物和微生物的生长(Inderjit,1996)，这在入侵植物和土著植物的竞争替代中扮演重要角色。因此，研究入侵植物化感物质的作用机制对揭示外来入侵植物的入侵机理具有重要意义。

薇甘菊MikaniamicranthaH.B.K.是我国华南地区危害最严重的外来入侵杂草，其化感作用很强，极易形成单优种群，扩张速度极快，素有“一分钟一英里”之称(Dayetal.,2016; Hanetal.,2017, 2018)。目前，有关薇甘菊化感物质的提取方法主要有2种：一是用水溶液提取水溶性化感物质，二是用有机溶剂萃取脂溶性化感物质。前人对薇甘菊水提液的化感作用进行了广泛的研究，多数研究表明，薇甘菊的水提液可显著抑制其他植物的种子萌发和幼苗生长，例如番茄LycopersiconesculentumMill.和白菜BrassicachinensisL.(Ismail & Chong,2002)，萝卜RaphanussativusL.、黑麦草LoliummultiforumL.、白三叶TrifoliumrepensL.、马占相思AcaciamangiumWilld.、马尾松PinusmassonianaL.、大叶桉EucalyptusrobustaSm.(邵华等, 2003)，紫薇LagerstroemiaindicaL.和刺槐RobiniapseudoacaciaL.(Wuetal., 2009)，牛筋草Eleusineindica(L.)Gaertn.、碎米莎草CyperusiriaL.和藿香蓟AgeratumconyzoidesL.(Ismail & Nornasuha,2014)等。然而，当前关于薇甘菊有机溶剂萃取物的化感作用研究较少。研究表明，薇甘菊地上部分有机溶剂萃取物对受体植物幼苗生长有一定的抑制作用，其中，乙酸乙酯萃取物的抑制作用最强，显示化感物质主要集中在乙酸乙酯部分(黄红鹃等,2003; 邵华等,2003)；但也有研究表明，薇甘菊其他的有机溶剂萃取物如石油醚粗提物，对受体植物幼苗生长没有明显的抑制作用(Shaoetal.,2005)。因此，研究比较薇甘菊水提物与有机溶剂粗提物的化感作用强弱有助于揭示薇甘菊化感作用的机理。

入侵植物除了对植物种子萌发和幼苗生长产生影响外，还可以通过化感作用来活化土壤养分资源，如氮、磷和钾养分，从而增加其对新生境的适应性和竞争力(侯玉平等,2013; 欧巧菁等,2020; Callawayetal.,2008)。氮是植物生长的必需元素，植物在生长发育过程中吸收的氮通常要高于其他矿质元素，因此，氮素常成为限制植物生长和外来植物入侵的主要元素(Kuypersetal.,2018)。已有研究表明，薇甘菊水溶性化感物质可促进土壤有效氮的释放，但是该过程是否对薇甘菊的生长产生有利的影响尚需要进一步验证。此外，薇甘菊脂溶性化感物质对土壤氮素的影响尚未见报道。因此，本研究通过对比分析薇甘菊水提液与有机溶剂粗提物的化感生测效果以及水提液和有机溶剂粗提物添加对土壤氮素的影响，并在此基础上提出“薇甘菊通过水溶性化感物质活化土壤氮素促进其自身生长而抑制其他植物生长”这一假设，以期为入侵植物的“化感利己作用”提供证据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

薇甘菊水提液的制备：将洗净后的薇甘菊及其2种本地伴生植物火炭母Persicariachinensis(L.)H.Gross和鸡屎藤Paederiascandens(Lour.)Merr.的新鲜叶片剪成<2 cm的片段后，分别配制成0.025 g·mL-1干重(dry weight, DW)水提液(即取2.5 g干重的供体植物的新鲜枝叶，加入超纯水100 mL)，室温下摇床浸提24 h，待用。

薇甘菊粗提物的制备：分别取25、50和100 mg膏状的乙酸乙酯粗提物用适量的乙酸乙酯溶解后用超纯水定容至50 mL，配制成500、1000和2000 mg·L-1乙酸乙酯粗提物；取适量的石油醚溶解后用超纯水定容至50 mL，配制成500、1000和2000 mg·L-1石油醚粗提物。

1.2 化感生物测定

吸取5 mL薇甘菊叶水提液和3 mL薇甘菊粗提物制备液，分别加入铺有双层滤纸的培养皿(直径11 cm)中，每皿均匀放置30粒已消毒的菜心BrassicacampestrisL.ssp.chinensisvar.utilisTsenet Lee种子(5.0%的次氯酸钠消毒10 min，再用蒸馏水洗净后浸泡3～5 h，选择饱满的种子做实验)，以超纯水为对照，每个处理组设10个重复，于人工气候箱中(RXZ智能型, 宁波江南仪器厂)保湿培养，白天温度/黑夜温度(各12 h)=30 ℃/25 ℃,湿度65%。每隔24 h适当添加薇甘菊水提液或相应浓度的粗提液，以保持滤纸湿润状态。当种子出现萌芽(胚根长度≥1 mm)后开始记录每天种子的萌发个数，7 d后统计萌发率(germination rate, GR)和发芽指数(growth index, GI)，并测定根长和苗高。

GR/%=(发芽种子数/供试种子数)×100；

GI=∑(Gt/Dt)，其中，Dt为发芽日数，Gt为与Dt相对应的发芽种子数。

化感效应指数(response index, RI)：RI=T/C-1(C为对照值，T为处理值)，当RI>0时，表示供体植物浸提液对受体植物种子萌发有促进作用；当RI<0时，表示供体植物浸提液对受体植物种子萌发有抑制作用。RI绝对值的大小代表化感作用强度。化感综合效应用上述几个测试项目的RI的平均值进行评价。

1.3 化感物质对土壤有机氮矿化的影响

采集薇甘菊单优种群的近邻土壤即薇甘菊较易入侵的脆弱土壤，过2 mm筛放入玻璃培养皿(直径12 cm)，每皿放100 g鲜土，添加薇甘菊水提液或不同浓度的粗提液进行培养，温度28～30 ℃，光照D/L=24 h/0 h。薇甘菊水提液浓度为0.025 g·mL-1DW，薇甘菊乙酸乙酯粗提物浓度为500 和1000 mg·L-1DW，薇甘菊石油醚粗提物浓度为1000和2000 mg·L-1DW，以添加超纯水作为空白对照。每个处理组设5个重复，每次喷2 mL，每隔1 d喷1次，共喷6次。上述土壤培养12 d后将玻璃培养皿中的土壤混匀取样，用0.01 mol·L-1的氯化钙震荡浸提1 h，土、水质量体积比为1∶10，然后用连续流动分析仪(Proxima, Alliance instruments, France)测定滤液中的铵态氮和硝态氮含量。

1.4 薇甘菊水提液对薇甘菊幼苗和火炭母幼苗生长的影响

1.4.1 实验设计 采集薇甘菊的新鲜叶片，装在网袋里置于天台阴凉处自然风干，然后将风干的叶片粉碎，并过2 mm筛。取磨碎的粉末24 g，加入1600 mL超纯水，搅拌均匀后于室温下浸提2 d；浸提结束后，用抽滤器抽滤2遍后，其浓度为15 g·L-1DW，之后依次稀释为11.25、7.50、3.75 g·L-1DW(Kauretal., 2012)；用超纯水作为薇甘菊水提液的空白对照，即0 g·mL-1DW。

将薇甘菊种子(中国农业科学院农业基因组研究所提供)和火炭母种子(购买于淘宝田埂上溪流里店铺)在1.0%次氯酸钠中浸泡10 min，再用超纯水洗涤3次，将已消毒的种子转移至盛有营养土的育苗盆中，置于培养箱中培养，温度(28±2)℃，湿度65%。培养2个月后，取大小一致的薇甘菊和火炭母幼苗(高度约15 cm)移栽至温室花盆中培养。花盆为无孔花盆(直径12 cm, 高13 cm)，每盆装鲜土约600 g，每盆种1株薇甘菊或火炭母幼苗。待幼苗定植良好后，每隔2 d淋灌上述薇甘菊水提液100 mL。每种植物淋灌的水提液有4种浓度，2种植物共8个处理，每个处理设4个重复，即薇甘菊和火炭母幼苗的植株个体数均为16株。30 d后，收集植物地上和地下部分生物量，放进信封里烘干，得到生物量干重，并测植物氮含量。此外，收集花盆里的土壤，混匀后过2 mm土筛，测土壤蛋白酶、铵态氮和硝态氮含量。幼苗于2018年4月24日移栽，于2018年5月24日收获。

1.商品的过度包装加重了消费者的经济负担，包装成本最终通过商品价格转移给消费者。商品的包装更多是保护商品免于受损，或者表现商品的相关特点，其本身并没有实用价值。比如，在天价月饼中，很多月饼的包装极其奢华，花样繁多，但是整个包装盒子并没有食用价值。

1.4.2 植物生物量与组织含氮量的测定 植物生物量测定采用烘干法，地上部分和地下部分分别装入信封，置于75 ℃烘箱内烘至恒重后称重，计算各部分生物量及其净增量。总生物量等于地上部分生物量与地下部分生物量的总和。取各植物烘干后的地上部分和地下部分，研磨过0.15 mm筛，使用TOC分析仪(LI-8100A, German Elementar Company)测植物各组织单位质量的含氮量。植物组织各部分(地上部分和地下部分)在生长期间的氮素积累总量，分别等于地上部分和地下部分单位质量氮浓度乘以各部分生物量净增量。植物总氮含量等于地上部分氮含量与地下部分氮含量的总和。

1.4.3 土壤氮素含量和酶活的测定 在收获盆栽植物的同时，采集根际新鲜土样，过2 mm筛，用0.01 mol·L-1的氯化钙震荡浸提1 h。土、水质量体积比为1∶10。用连续流动分析仪测定土壤铵态氮和硝态氮含量。采用酪蛋白酸钠分析法测定土壤蛋白酶活性(吴金水等, 2006)。具体操作：取2.5 g过1 mm筛的新鲜土样置于50 mL离心管，加入12.5 mL 50 mmol·L-1Tris缓冲液(pH=8.1)和12.5 mL 2.0%酪蛋白酸钠溶液，混匀，然后置于50 ℃水浴摇动培养2 h，取出后加入12.5 mL 15.0%三氯乙酸溶液，混匀后过滤，取5 mL滤液于50 mL离心管中，加入7.50 mL碱性试剂，混匀后置于室温下反应15 min，然后加入5 mL的33.0% 福林试剂，混匀过滤并在室温下反应1 h，最后取滤液在紫外分光光度计(UV-2450)700 nm处比色测定。

1.5 数据的统计与分析

使用SPSS 18.0软件(SPSS Inc., USA)进行统计分析。本研究中为控制试验，符合正态分布，方差齐性检验(P>0.05)，方差具有齐性。采用单因素方差分析薇甘菊叶水提液和粗提物生测实验中的萌发率、根长、苗高和发芽指数以及外源添加叶水提液和粗提物实验中土壤铵态氮和硝态氮含量的差异性；同样地，采用单因素方差来分析盆栽实验中薇甘菊幼苗和火炭母幼苗中的植物生物量、植物组织氮积累量、土壤氮素含量和土壤酶活之间的差异。方差分析P<0.05，表明至少2个处理间有差异。采用Duncan′s法进行多重比较(P<0.05)。对于薇甘菊水提液和空白对照之间的土壤铵态氮和硝态氮含量的差异采用2个独立样本T检验进行分析。用Origin 8.5作图。

2 结果与分析

2.1 薇甘菊水提液和粗提物的生测效果

2.1.1 水提液的生测效果 除了发芽指数在火炭母和对照之间没有显著性差异外，薇甘菊与2个本地伴生种(鸡屎藤和火炭母)均显著降低了菜心种子的萌发率、根长、苗高和发芽指数(表1)。此外，3种植物的化感综合效应结果表明，薇甘菊叶水提液对菜心种子的化感抑制作用最强(-11.70)，鸡屎藤次之(-8.72)，火炭母最弱(-0.75)(表2)。

表1 薇甘菊及其2个伴生种的叶水提液对菜心种子萌发和生长的影响

表2 薇甘菊及其2个伴生种的叶水提液对菜心种子萌发和生长的综合效应

2.1.2 粗提物的生测效果 薇甘菊乙酸乙酯粗提物主要是抑制菜心种子的萌发率，特别是2000 mg·L-1的乙酸乙酯粗提物对菜心种子的萌发率抑制作用最强；乙酸乙酯粗提物对根长没有显著性影响，但是1000和2000 mg·L-1的乙酸乙酯粗提物对苗高有明显的促进作用(表3)。此外，不同浓度的石油醚粗提物均对菜心种子的萌发率也具有显著的抑制作用，其中，2000 mg·L-1的石油醚粗提物的抑制作用最强；但2000 mg·L-1的石油醚粗提物显著增加了菜心种子的苗高(表3)。化感综合效应结果表明，与薇甘菊水提液相比，薇甘菊乙酸乙酯粗提物对菜心种子具有微弱的化感抑制作用，薇甘菊石油醚粗提物对菜心种子具有微弱的化感促进作用(表4)。

表3 薇甘菊的乙酸乙酯粗提物和石油醚粗提物对菜心种子萌发和生长的影响

表4 薇甘菊的乙酸乙酯粗提物和石油醚粗提物对菜心种子萌发和生长的综合效应

2.2 薇甘菊水提液和粗提物对有机氮矿化的影响

薇甘菊水提液处理后土壤铵态氮含量为5.61 mg·L-1，与对照相比显著降低(P<0.01)，但硝态氮含量(62.51 mg·L-1)与对照相比显著增加(P<0.05)。外源添加薇甘菊乙酸乙酯粗提物和石油醚粗提物显著降低了土壤铵态氮和硝态氮含量，其中2000 mg·L-1的石油醚粗提物对铵态氮的抑制作用最强，与空白对照相比，其土壤铵态氮含量降低了45.5%；而乙酸乙酯粗提物对硝态氮的抑制作用更强，与空白对照相比，添加了500和1000 mg·L-1乙酸乙酯粗提物的土壤中的硝态氮含量分别降低了93.6%和 95.6%(图1)。

2.3 薇甘菊水提液对薇甘菊幼苗生长的影响

2.3.1 植物生物量和植物组织含氮量的变化 薇甘菊的总生物量随着水提液浓度的增加而显著升高(R2=0.620,P<0.001)，与对照(0.00 g·L-1)相比，在高浓度(15.00 g·L-1)处理下显著增加了52.0%；而火炭母总生物量则表现出相反的趋势，随着薇甘菊叶水提液浓度的增加而显著下降(R2=0.686,P<0.001)，在高浓度(15.00 g·L-1)处理下显著下降了51.7%(图2)。随着薇甘菊叶水提液的浓度增加，薇甘菊地上、地下部分及整株植物的氮含量呈上升趋势；但薇甘菊叶水提液处理火炭母后，其各部分的氮含量变化趋势则相反，呈下降趋势(图3)。

图2 薇甘菊叶水提液对薇甘菊及其伴生种火炭母生物量的影响(n=4)

图3 薇甘菊叶水提液对薇甘菊及其伴生种火炭母植物组织氮含量的影响(n=4)

2.3.2 土壤氮素和蛋白酶活性的变化 入侵植物薇甘菊根际土壤的铵态氮和硝态氮含量，以及本地植物火炭母根际土壤的硝态氮含量随着薇甘菊水提液处理浓度的增加而上升，但薇甘菊硝态氮含量的增加幅度大于铵态氮含量。相反地，本地植物火炭母根际土壤的铵态氮含量随着薇甘菊水提液处理浓度的增加而下降(图4)。此外，与对照处理(0.00 g·L-1)相比，薇甘菊根际土壤蛋白酶活性在高浓度(15.00 g·L-1)处理下显著增加了18.8%，而火炭母根际土壤蛋白酶活性则降低了55.0%。随着薇甘菊叶水提液浓度升高，入侵植物薇甘菊根际土壤的蛋白酶活性逐渐增加，而本地植物火炭母根际土壤的蛋白酶活性则表现出相反的趋势(图5)。

图4 薇甘菊叶水提液对薇甘菊及其伴生种火炭母植物土壤氮含量的影响(n=4)

3 结论与讨论

化感作用是入侵植物和本地植物之间普遍存在的一种现象(Hierro & Callaway,2003; Tesio & Ferrero,2010)，研究表明，化感武器是外来植物成功入侵的重要机制之一(陈锋等, 2017; Baisetal.,2003; Callaway & Ridenour,2004; Uddinetal.,2017)。本研究发现，薇甘菊水提液与粗提物的化感作用强度以及对有机氮矿化的影响存在显著差异，薇甘菊水提液显著促进了薇甘菊的生长，有明显的化感利己作用，这为“化感新武器”假说提供了新的证据。

3.1 薇甘菊水提液与粗提物的化感作用差异

薇甘菊的许多组织提取物如叶(梁斌等,2006)、茎、根(Nietal.,2006; Wuetal.,2009)、凋落物(Ismail & Chong,2002)，甚至是林下土壤及其提取物(Ismail & Mah,1993; Kauretal.,2012; Zhao & Peng,2009)都被证明具有化感作用。很多研究对比了薇甘菊叶和根的化感作用强弱(邵华等,2003; Dorning & Cipollini,2006; Sunetal.,2006; Wuetal.,2010)，但是对薇甘菊水提物和粗提物化感作用强弱的比较研究较少。本研究发现薇甘菊水提液的化感抑制作用不但显著高于2个本地伴生种鸡屎藤和火炭母，而且远大于薇甘菊粗提物的化感作用。这与Wuetal.(2015)的研究结果相一致，该研究发现薇甘菊叶水提液物显著抑制了26种植物的种子萌发率、初始萌发时间和发芽速率以及幼苗的根干重、芽干重、叶面积等指标。这是由于化感物质通常是水溶性的(Turketal.,2003)，薇甘菊叶片中含有大量的水溶性酚类化合物(王建国等,2013; Liuetal.,2020; Xuetal.,2013)，这些酚类化合物，如阿魏酸和绿原酸，可以显著抑制其他植物如拟南芥Arabidopsisthaliana(L.)Heynh.、苜蓿MedicagosativaL.、水稻OryzasativaL.和稗草Echinochloacrusgalli(L.)Beauv.的种子萌发和幼苗生长(宋亮,2006; 王建国等,2013; Liuetal.,2020)。其原因在于这些水溶性化感物质可以导致种子快速且显著的电解质渗漏，从而造成质膜损伤，引起种子发芽率和活力下降(Wuetal.,2010)。

3.2 薇甘菊水提液和有机粗提液对土壤有机氮矿化的影响

薇甘菊入侵后能显著提高土壤的硝化速率，并且增加土壤中铵态氮和硝态氮的含量(刘小文等,2012; Lietal.,2007)，从而增强其入侵趋势。本研究中直接向裸土中外源添加薇甘菊的水提液和粗提液，结果显示，薇甘菊水提液显著增加了土壤硝态氮的含量，这与Chenetal.(2009)的研究发现外源添加薇甘菊水提液有助于促进土壤硝化速率、提高土壤中硝态氮含量的研究结果相一致。但是本研究中薇甘菊乙酸乙酯粗提物和石油醚粗提物均显著抑制了土壤有效氮的生成。显然，薇甘菊主要通过水提液来增加土壤氮素含量，而非有机粗提液，这可能是因为2种提取液中所含的化感物质不同。有研究报道，薇甘菊水提液含有大量酚类化合物(王建国等,2013; Liuetal.,2020; Xuetal.,2013)，这些酚酸化合物可以作为微生物的碳源，为其提供能量来增加土壤氮转化功能菌的数量，进而影响土壤的氮素含量(谭秀梅等,2006; Chan,1986)。例如李春龙(2017)研究发现，酚酸化合物-阿魏酸可以提高土壤硝态氮的含量，且浓度越大，促进效果越显著。而薇甘菊有机粗提物中主要分离出的是倍半萜内酯和黄酮类化合物(Huangetal., 2008; Shaoetal., 2005; Weietal., 2004)，这些化合物能够抑制病原菌的生长(庄世宏等, 2010; Faceyetal., 1999)，但是目前有关其影响土壤氮素转化过程的机理尚不清楚，需进一步研究。

3.3 薇甘菊水提液的化感利己作用

在本研究中，经薇甘菊叶水提液处理后，薇甘菊的总生物量和植物氮含量显著升高；本地植物火炭母的总生物量和植物氮含量随着薇甘菊叶水提液浓度的升高显著下降。这是因为薇甘菊叶水提液显著提高了薇甘菊生长土壤中的蛋白酶活性，从而促进了土壤有效氮的释放，为薇甘菊的生长提供了充足的养分，这与本实验中检测到薇甘菊土壤中含有较高的蛋白酶活性、较高的铵态氮和硝态氮含量相一致。姜朝阳等(2020)研究发现，薇甘菊叶水提液对其自身具有较强的化感促进作用。这是因为入侵植物分泌的化感物质可以影响土壤中的微生物群落，从而改变土壤中氮素矿化过程(Chenetal.,2009; 侯玉平,2013)。薇甘菊可能通过分泌某种化感物质(如咖啡酸、对羟基苯甲醛、间苯二酚和香草酸等)来促进对自身有益的微生物繁殖或减少本地植物生长土壤中有益菌数量来影响土壤有效氮的生长，从而创造了一个利己环境(陈宝明等,2018; Ismail & Chong,2002)。

此外，薇甘菊的利己作用也可能与入侵植物本身存在解毒机制有关。Lietal.(2017)在紫茎泽兰AgeratinaadenophoraSpreng.入侵土壤中发现能够降解其化感物质的微生物活性较高，对化感作用的缓解速度较快。研究表明，阿魏酸是薇甘菊体内具有较强化感活性的物质，其在化学竞争机制中起重要作用(李拥军,2008; 王建国等,2013)。相对而言，本地植物火炭母可能由于缺乏相应的解毒机制，使薇甘菊水提液中的某些化感物质(如阿魏酸)抑制了土壤微生物分泌胞外酶如蛋白酶，从而限制土壤养分的释放和植株的生长(Souza-alonsoetal.,2014)。

综上所述，薇甘菊水提液的化感抑制作用较强且促进了土壤硝态氮的生成，粗提物的化感抑制作用较弱且抑制了土壤铵态氮和硝态氮的生成。与本地伴生种相比，薇甘菊水提液具有显著的化感利己作用，这是因为薇甘菊水提液提高了土壤蛋白酶活性，从而增加了土壤有效氮的释放。由此可见，薇甘菊的化感利己作用主要通过水溶性化感物质促进有效氮的生成来实现，而非脂溶性化感物质。