王荣昌 甘露 王玉莹 郭艳霞 刘洁 徐慧 苏爱艳 望文阁 朱泽宇 王小军

摘要 [目的]研究牛初乳冻干粉（LBC）和复合制剂对维甲酸所致骨质疏松症的预防和抗氧化作用。[方法]以维甲酸灌胃14 d建立小鼠骨质疏松动物模型，在造模的同时给予LBC和复合制剂。动物处死后，测定股骨矿物元素含量和血清生化指标，分析血液和脏器SOD活性和MDA含量。[结果]LBC和复合制剂能明显抑制骨质疏松症小鼠骨Ca、P和Zn的丢失。LBC和复合制剂能显著提高血液SOD活性，降低血液、肝脏、肾脏和睾丸MDA含量。LBC能提高肝脏、脾脏SOD活性;复合制剂能显著提高脾脏、睾丸SOD活性。LBC和复合制剂能降低血清胆固醇含量。[结论]LBC及复合制剂能抑制骨矿物元素的丢失，提高血液和主要组织的抗自由基损伤的能力，对骨质疏松症有较好的改善和抗氧化作用。

关键词 牛初乳冻干粉;复合制剂;维甲酸;骨质疏松症;抗氧化作用

中图分类号 TS252.1文献标识码 A文章编号 0517-6611（2021）10-0157-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.10.042

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effect of Lyophilized Bovine Colostrums and Compound Preparation on Prevention and Antioxidation of Retinoic Acid Induced Osteoporosis in Mice

WANG Rong-chang，GAN Lu，WANG Yu-ying et al

（Jiangsu TMG Nature Biological Engineering Co.， Ltd.，Nanjing， Jiangsu 210046）

Abstract [Objective] To investigate the preventive and antioxidative effects of lyophilized bovine colostrums （LBC） and compound preparation （CP） on osteoporosis induced by retinoic acid in mice. [Method] The mice osteoporosis was induced by given retinoic acid intragastrically for two weeks， at the same time of modeling， mice were given LBC and CP. The content of femoral Ca， P and Zn and biochemical indexes in serum were assayed. The SOD activities and MDA concentrations of blood and main tissues were determined. [Result] Compared with model group， LBC and CP group can obviously inhibit the loss of bone Ca， P， Zn. The SOD activity of blood in LBC and CP group were higher than the model group and the levels of MDA in blood， liver， kidney and testes were lower than the model group. Compared with model group， the SOD activity in liver and spleen of LBC group and in spleen and testes of CP group increased significantly. The SOD activity of blood in LBC and CP group were higher than the model group. The levels of TC in LBC and CP groups were lower than the model group. [Conclusion] LBC and CP can prevent the loss bone and enhance the antioxidant capacity of blood and main tissues， and have prevention and antioxidant effects on osteoporosis induced by retinoic acid in mice.

Key words Lyophilized bovine colostrums;Compound preparation;Retinoic acid;Osteoporosis;Antioxidation

骨質疏松症是一种骨量降低、骨组织显微结构退化，导致骨脆性增加，骨折危险性增高的全身性疾病，是中老年人特别是绝经后妇女易患的疾病之一。随着我国进入老龄社会，骨质疏松症的发病率持续增高，我国骨质疏松症患者约有0.9亿人[1]，其中妇女绝经后骨质疏松约占80%[2]。目前，针对骨质疏松的治疗缺乏特效的方法，药物治疗有副作用。我国动植物资源丰富，因此从中开发安全、高效具有增加骨密度功能的保健食品有广阔的市场应用前景。

牛初乳是指奶牛分娩后7 d 内所分泌的乳汁，它不仅含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素和矿物质等人体必需的营养物质，还含有大量的免疫因子[3]和90余种活性物质[4]，是除人初乳外唯一富含生长因子和免疫因子的天然食物[5]。2000 年牛初乳被美国食品科技协会列为21 世纪最佳发展前景的非草药类天然健康食品，已成为新一代功能性食品资源库[6]。研究表明，牛初乳能缓解轮状病毒引起的小鼠腹泻症状[7]，在肠道炎症和感染的体外模型中具有消炎和抗菌活性[8]，牛初乳制备物能诱导胰岛β细胞增殖，阻碍啮齿动物Ⅰ型糖尿病的发展[9]，最近发现牛奶中的一种抗氧化肽能预防氧化应激所致的成骨细胞功能紊乱[10]。

牛初乳冻干粉是以牛初乳为原料，经冷冻干燥工艺加工而成的一种天然牛初乳制品，保留了除脂肪外的几乎所有营养物质和生物活性物质，已报道它具有抗衰老和活性氧清除作用[11-12]，能促进胎鼠骨骼发育和成骨细胞增殖[13]，具有降血糖和抗氧化作用[14]，但在预防骨质疏松症方面报道不多。笔者在建立小鼠维甲酸骨质疏松症动物模型的基础上，对牛初乳冻干粉和复合制剂预防骨质疏松及其抗氧化作用进行研究，旨在为骨质疏松症的预防和治疗提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

牛初乳冻干粉（LBC），由牛初乳离心脱脂后经冷冻干燥工艺加工而成，免疫球蛋白G含量为20.0%，蛋白质为45.0%。复合制剂由江苏天美健大自然生物工程有限公司提供，组成成分为LBC、大豆异黄酮和超细鲜骨粉按一定比例加工而成，其中大豆异黄酮含量为4.5%，免疫球蛋白G含量为14.2%，蛋白质含量为31.0%，钙含量为9.2%。维甲酸胶囊（商品名迪维胶囊），重庆华邦制药股份有限公司产品。

ME155DU型电子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司;HG9620A型原子吸收分光光度计，沈阳华光精密仪器有限公司;Z36HK 型高速冷冻离心机，德国Hermle 公司;EV300型紫外可见分光光度计，美国Thermo fisher公司。

氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、硫代巴比妥酸（TBA）（国药集团化学试剂有限公司）;四甲氧基丙烷、考马斯亮蓝G250、BSA（Sigma公司）;硝酸、高氯酸为优级纯，其他试剂为国产分析纯或生化试剂。

1.2 试验分组及动物模型制备

昆明种雄性小鼠40只，清洁级，体重（25±2） g，由江苏省医科大学实验动物中心提供。小鼠常规饲养7 d后随机分为4组，每组10只，即对照组（A组）、模型组（B组）、LBC组（C组）和复合制剂组（D组）。每天上午C、D组分别灌胃给予LBC（剂量为350 mg/kg）和复合制剂（剂量为350 mg/kg），A、B组灌胃给予等量蒸馏水，下午除A组给予蒸馏水外，其余各组均灌胃给予维甲酸（150 mg/kg），连续饲养14 d[15]。试验期间动物自由摄食，饮水，每2 d称重以调整给药量。第15天禁食12 h，摘眼球取血分离血清，动物处死后解剖，分离股骨测定Ca、P、Zn等含量，取各脏器制备组织匀浆，进行各项生化指标测定。

1.3 方法

1.3.1 脏器指数的测定。

取脏器用定性滤纸吸除表面污血后，在分度值为万分之一电子分析天平上称重，脏器指数以mg组织/g体重表示。

1.3.2 骨和血清中矿物元素含量的测定。

取小鼠双侧股骨，剔去肌肉等软组织后于105 ℃干燥至恒重，用分析天平称量骨干重，用游标卡尺测量骨长度。股骨中Ca、P、Zn和血清中Ca、P含量测定采用混合酸（硝酸∶高氯酸=4∶1）消化法，分别按GB/T 5009.92—2003、GB/T 5009.87—2003和GB/T 5009.14—2003测定。

1.3.3 血液和组织样品的制备。

小鼠剪尾取20 uL血液，加入到1 mL蒸馏水中，充分溶血，制备2%溶血液用于血液MDA含量测定。另取20 uL血液于1.5 mL生理盐水中立即混匀，4 000 r/min 离心5 min，收集红细胞，加入0.2 mL蒸馏水溶血，向溶血液中加入0.1 mL 95%乙醇混匀后，再加入0.1 mL氯仿，振蕩后于4 000 r/min 离心5 min，取上清液用于SOD活性测定。

组织样品用生理盐水冲洗，拭干，剪碎，加入预冷的50 mmol/L 磷酸缓冲液（pH 7.8），于冰浴中进行超声波破碎（400 W，20 s×2）制备10% 组织匀浆（W/V），再经10 000 r/min离心10 min，上清液用于SOD活性或MDA含量测定。

1.3.4 SOD活性的测定。

按Stewart等[16]的NBT光化还原法测定SOD活性，血液SOD活性以U/mL血液表示，组织SOD活性以U/mg蛋白表示。

1.3.5 MDA含量的测定。

MDA含量测定采用TBA比色法[17]，结果以nmol/mL血液或nmol/mg组织表示。

1.3.6 蛋白质含量的测定。

蛋白质含量测定采用Breadford法[18 ]，以BSA为标准蛋白。

1.3.7 血糖、血清胆固醇的测定。

血糖测定采用邻甲苯胺微量法[19]，血清胆固醇测定采用邻苯-甲醛法[20]。

1.3.8 统计分析。

采用SPSS 10.0软件处理数据，进行方差分析和显著性检验，试验数据用M±S表示，P<0.05 表示差异显著，P<0.01 表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 试验观察及脏器指数测定

小鼠连续灌胃给予维甲酸后，模型组小鼠活动缓慢，倦缩，弓背，毛发易脱落，体重减轻，在给予LBC和复合制剂后，病症明显有所缓解。各组间脏器指数测定无明显差异，均在正常波动范围内（表1）。

2.2 对血液生化指标的影响

由表2可知，C、D组的血糖、Ca、P含量指标虽较B组有所增加，但无统计学差异。血清胆固醇测定结果表明，B组血清胆固醇明显升高（P<0.05），在给予LBC和复合制剂后，C、D组分别比B组降低37.6%和53.8%，且有显著差异（P<0.05）。这说明LBC和复合制剂均能降低血清胆固醇水平，有利于缓解骨质疏松所致脂代谢水平异常。

2.3 对股骨长度、质量和Ca、P、Zn含量的影响

由表3可知，B组的股骨质量和长度低于CK，但差异不显著;在给予LBC和复合制剂后，C、D组股骨质量和长度比B组有所增加，也无显著差异。B组的股骨中Ca、P、Zn含量均显著或极显著低于CK（P<0.05或P<0.01），提示骨质疏松模型成立。在给予LBC和复合制剂后，与B组相比，C、D组的Ca、P、Zn含量分别增加了21.0%、34.7%、98.5%和34.7%、30.5%、78.2%。可见，LBC和复合制剂在增加骨质疏松动物的骨矿质元素含量方面都有明显作用。

2.4 对SOD活性的影响

由表4可知，造模后B组的血液、肝脏和脾脏SOD活性与CK相比显著或极显著下降（P<0.05或P<0.01），在给予LBC和复合制剂后，C、D组血液SOD活性分别比B组提高38.1%、49.1%，脾脏SOD活性比B组增加了106.5%和117.5%，且差异显著（P<0.05）;同时，与B组相比，LBC能显著提高肝脏SOD活性（P<0.01），复合制剂（D组）能显著提高睾丸SOD活性（P<0.05）。可见，LBC和复合制剂均能提高血液和主要组织的SOD活性，对骨质疏松所致的自由基平衡失调有较好的缓解作用。

2.5 对MDA含量的影响

由表5可知，血液和脾脏MDA含量在造模后升高。与CK相比，B组的肝脏、肾脏和睾丸的MDA含量显著或极显著提高（P<0.05或P<0.01），在给予LBC 和复合制剂后，与B组相比，C、D组血液、肝脏、肾脏和睾丸的MDA含量降低，有显著或极显著差异（P<0.05或P<0.01）。这说明LBC和复合制剂能通过抑制血液和组织脂质过氧化反应，降低对机体和骨组织过氧化损伤的风险。

3 讨论

（1）Ca、P是骨的主要组成成分，人体中约有99%的Ca和85%的P存在于骨中，骨矿物质主要作用是促进骨基质的合成和骨矿沉积[21]，骨中矿质元素的丢失是造成骨质疏松的主要原因。该研究显示，造模后小鼠股骨Ca、P等元素显著低于CK，提示骨矿质元素丢失严重，维甲酸所致骨质疏松模型成立。在给予LBC和复合制剂后，骨Ca、P含量分别比模型组显著提高，且达到了CK水平。说明LBC和复合制剂能抑制维甲酸所致小鼠骨矿质的丢失，维持骨的正常代谢水平，有助于骨质疏松的预防。

（2）Zn参与骨骼的代谢，影响成骨形成[22]。在骨重塑方面，Zn是骨矿化过程重要的AKP 酶的辅基，AKP被认为是反映成骨细胞活性及骨形成的指标之一[23]，缺Zn会影响AKP 酶活性，间接地干扰骨的矿化。同时，Zn也是CuZn-SOD的催化辅基，缺Zn会导致抗氧化酶合成障碍，加剧机体的氧化应激损伤水平。造模后小鼠骨Zn含量下降，可能间接导致血液和主要组织Zn代谢水平失调，从而影响SOD活性和骨代谢水平。LBC和復合制剂能提高骨Zn含量，有助于维持正常骨代谢和抗氧化酶水平。

（3）LBC不仅含有人体必需营养物质，还含有多种调节骨代谢的生长因子，其中胰岛素样生长因子-1（IGF-1）是牛初乳中含量最高的生长因子，在LBC中含量达 μg/g 水平，其中80%以上是以高生理活性的游离态存在[14]。IGF-1 被认为是多种激素和因子调节骨代谢复杂网络的核心因素，是骨源性生长因子成分之一，能够促进细胞的增殖分化，增强成骨细胞活性及其对Ca、P的吸收[1]。补充外源性骨生长因子可促进成骨代谢，改善骨结构，提高骨密度[24]。牛初乳提取物能促进胎鼠骨骼发育和成骨细胞增殖，在促进骨骼发育方面的效果优于活性钙，与其IGF-1密切相关[13]。可见，LBC中的这些生长因子对骨质疏松的预防和改善起到了积极的作用。

（4）复合制剂中不仅含有LBC，还含有大豆异黄酮和生物性钙源，对骨质疏松表现出与LBC相似的改善效果。大豆异黄酮具有雌激素样作用，在预防骨质疏松症方面的报道较多，84～126 mg/d剂量能减缓绝经后妇女骨丢失，维持骨密度的相对稳定，其显效剂量为126 mg/d[25]，每日摄入90 mg/d异黄酮人群的脊椎骨密度明显上升[26]，与复合制剂中大豆异黄酮供给量101 mg/d的水平接近。已报道大豆异黄酮能改善去势雄性大鼠血和尿的骨代谢生化指标[27]，能有效预防绝经后妇女骨丢失[28]。超细鲜骨粉为生物性钙源，它的钙磷比合理，比其他无机钙源更有利于生物体的吸收和利用。骨粉经超微粉碎后，粉体变细，表面积增大，其吸收率、钙存留率、股骨矿盐含量、矿盐密度和钙含量均显著高于普通骨粉[29]。该研究表明，复合制剂能改善骨质疏松症小鼠的骨丢失，大豆异黄酮和超细鲜骨粉在其中起着重要作用。

（5）氧化应激是骨质疏松症的重要发病机制，氧化应激活性率（ROS）能促进破骨细胞分化和骨细胞凋亡，同时抑制成骨细胞活性诱导骨吸收[30]，其在骨质疏松中扮演着重要角色。SOD是体内主要抗氧化酶，能清除ROS保护机体免受氧化损伤，在抗氧化平衡系统中起着重要作用。MDA是脂质过氧化的终产物，已被广泛作为ROS损伤脂质分子的一个标记物，间接地反映细胞损伤情况。该研究中造模后小鼠血液和主要组织SOD活性下降，MDA含量水平上升，说明造模后导致机体氧化应激反应发生。相关研究表明，去卵巢鼠导致肝脏和肾脏中SOD活性下降，MDA含量上升[31-32]，骨质疏松患者红细胞MDA含量显著高于正常组[33]，血清MDA含量升高，而SOD等抗氧化剂的活性降低，提示骨质疏松发生时存在氧化损伤，体内抗氧化平衡被打破[34]。LBC和复合制剂能提高血液和主要组织SOD活性、降低MDA含量，提示LBC和复合制剂能通过清除体内自由基，来维持抗氧化系统平衡，减轻氧化应激所致的血液和组织的氧化损伤，有利于降低骨质疏松发生的风险。

（6）骨质疏松症是中老年人常见的退行性疾病，与机体衰老密切相关。LBC和复合制剂含有丰富的蛋白质和高含量的免疫球蛋白，有助于增强老年人的体质和机体免疫功能，预防骨质疏松的发生。已报道牛初乳提取物能提高老年人血清总SOD和Mn-SOD活性，降低脂质过氧化物水平[35]，提高衰老小鼠血液SOD活性，降低血清MDA和心肌脂褐质含量[11]，对吸收O3的小鼠具有抗自由基损伤作用[12]。有研究显示，LBC 具有清除自由基作用[14]，牛奶抗氧化肽能通过增加成骨细胞基因表达和抗氧化酶活性来促进成骨细胞分化[10]。说明牛初乳成分能增强机体ROS清除能力，对中老年人的自由基平衡失调和骨细胞的氧化损伤有积极的改善作用，这可能是LBC和复合制剂对小鼠骨质疏松症有改善的另一原因。

（7）综上所述，LBC和复合制剂能提高维甲酸所致骨质疏松小鼠的骨Ca、P、Zn的含量，抑制骨矿质元素的丢失，同时能提高血液及主要组织SOD活性，降低MDA含量，预防氧化应激对机体和组织的损伤作用，说明LBC和复合制剂对小鼠骨质疏松症有较好的改善和抗氧化作用。

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