朱先飞 吴洁 杨焰华 李婧婧 付求来 李威

摘 要：利用已经克隆的ZmCCT基因的核酸序列，在基因功能区设计新引物，鉴定到针对安徽丰大种业股份有限公司玉米骨干自交系0908的功能区序列差异，开发了基于PCR的新的插入/缺失（insert-deletion，InDel）标记，标记与基因功能紧密连锁。通过扩增、电泳检测和接种鉴定，结果表明，新开发的标记能有效地鉴别玉米茎腐病抗性，可用于分子标记辅助育种。

关键词：玉米;茎腐病;抗性基因;分子标记辅助育种

中图分类号 S274.1文献标识码 A文章编号 1007-7731（2021）08-0015-03

Abstract： Based on the cloned nucleic acid sequence of ZmCCT gene， new primers were designed in the functional region of the gene， and the sequence differences of the functional region of our Backbone Inbred Line 0908 were identified. A new insert deletion （indel） marker based on PCR was developed， which was closely linked with the gene function. Amplification and electrophoresis showed that the primer amplification was stable. The results showed that the newly developed marker could effectively identify the resistance of maize to bacterial wilt and could be used in molecular marker assisted breeding.

Key words： Corn; Stem rot; Resistance gene; Molecular marker assisted breeding in maize

玉米茎腐病又称青枯病，是国内外玉米生产中的重要病害之一，近年来，随着机械收获和籽粒直收，茎腐病已成为玉米生产中极具威胁性的病害[1]。一般发病年份，茎腐病田间发病率在5%～10%，在病害重发年份，田间发病率可达20%～30%，一些高感病品种的发病率达40%～100%[2]。目前，最经济有效的防治手段是培育抗病品种。李莉等[3]研究表明，利用分子标记辅助选择（markerassistedselection，MAS）结合常规育种方法，可快速有效地定向改良骨干系的抗病性，为抗病新品种选育提供优良的亲本材料。

Yang等[4]用自交系1145×Y331的F2、BC2F1和BC3F1群体作为研究群体，证实qRfg1为抗茎腐病主效QTL，通过追踪BC4F1至BC6F1代的精细定位研究，认为qRfg1通过发挥遗传能力能显著提高玉米的抗茎腐病能力。Qing等[5]报道这个抗病QTL是一个包含CCT结构域的基因，命名为ZmCCT，包含CCT结构域的这类基因可能通过影响光周期进而影响农作物的其他农艺性状，是一個有重大价值、可应用于作物遗传改良的关键基因。

1 材料与方法

1.1 供试材料 携带抗性基因的为玉米1145自交系，1145抗病强、抗谱广[6]，0908是安徽丰大种业选育的玉米骨干自交系，但是在茎腐病易发地区表现感病。本研究以1145和0908分别为供体和受体材料，以及1145×0908的F1、F2为测试材料。

1.2 DNA提取 采用碱煮法提取[7]，切取1/20大小的玉米籽粒胚乳，加入40mL的0.2Mol/L的氢氧化钠水溶液，在100℃条件下水浴3min，再加入60mL的0.17Mol/L的tris-HCL，在100℃条件下水浴1min，取出后放4℃冰箱备用。

1.3 PCR扩增 含Mg2+的10X Buffer 2μL，10mM的dNTP 0.4μL，5μM的如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列和5μM的如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列各2μL，从待测玉米中提取的基因组DNA 1μL，5U/μL的taq酶0.5μL，其余为超纯水，反应体积为20μL，滴加1滴矿物油覆盖;PCR扩增的反应程序为：94℃5min;94℃60s，53.5℃60s，72℃60s，35个循环;72℃10min。

1.4 聚丙烯酰胺电泳检测 用6%的聚丙烯酰胺变性凝胶电泳检测PCR产物，主要包括以下3个步骤：（1）制胶：称取9.6g尿素，加45mL蒸馏水和8mL 10×TBE，搅拌溶解，加入12mL40%丙烯酰胺溶液，混匀后加入0.8mL 10%过硫酸铵和35μL TEMED，搅拌均匀后立即注入已用琼脂糖凝胶封口的玻璃板中，注满后倾斜放置。插入梳子，静置，使胶凝固;（2）点样：待胶完全凝固后，小心拔出梳子，尽量保持点样孔完整。将玻璃板固定垂直电泳槽上，加入适量的1×TBE电泳缓冲液;取PCR扩增产物，每管PCR产物中加入4μL上样缓冲液（0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯氰、50%甘油），混匀后用微量进样器吸5μL注入点样孔;（3）电泳：调电压至200V，电泳时间约3～4h。电泳完毕后，将玻璃板从电泳槽上拆下，取出凝胶，在蒸馏水中漂洗2次;转移至0.1%AgNO3溶液中染色，在摇床上轻摇约10min;然后将凝胶转移至蒸馏水中漂洗2次;最后转入显色液（6g氢氧化钠、0.076g四硼酸钠、1.6mL甲醛，加水定容至400mL）中显色约10min，着色后用水漂洗2次，终止显色反应并去除附着的显色液。用凝胶成像系统记录结果。

1.5 引物设计

1.5.1 双亲基因组扩增和测序 采用碱煮法提取1145和0908叶片的基因组DNA，以Qing等[5]公布的序列，设计引物，由核苷酸序列5′-tctggcaggattggaaaatatct-3′和核苷酸序列5′-atatcgcagaatctggtagcca-3′组成，委托北京梓熙生物公司合成后，进行PCR扩增。PCR扩增产物送去测序，测序公司为北京梓熙生物公司。

1.5.2 引物设计 测序结果在NCBI网站进行在线比对，结果见图1。图中虚线区域表示41bp的缺失，其中query代表1145父本，高抗茎腐病的序列;sbjct代表0908母本，不抗茎腐病的序列。表明0908在此区域多了41bp碱基。根据图1的测序比对结果，利用在线引物设计软件Primer3.0设计引物。在跨越2个序列有41bp插入缺失差异区域设计引物。设计完成的新引物命名为ZmCCT-2016，上游引物核苷酸序列为5′-ctagttcatttttcaagatc-3′，下游引物核苷酸序列为5′-atatcgcagaatctggtagcca-3′。委托北京梓熙生物公司合成。上游引物和下游引物均位于基因ZmCCT内部功能区域。

1.6 茎腐病病菌接种与调查 在玉米播种时、覆土前，将带有病原菌的玉米籽粒均匀盖在种子上面、种后灌溉1次，此后保持充足的土壤水分。所使用的病原菌由安徽农业大学提供。发病后，通过田间鉴定，叶片茎腐或黄枯，果穗倒挂，茎基变软变褐并腐烂的，则认为是感病株，其他记为抗病植株。对田间调查结果进行记录。

2 结果与分析

2.1 引物效果 利用新合成的引物扩增1145和0908以及两者的杂交种F1。PCR扩增产物用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，快速银染法染色并观察拍照，见图1。图中0908、1145和杂交种，每个材料各2个重复，Marker大小为250bp。对PCR扩增产物进行测序，从扩增产物的电泳图可以清晰地看出，1145只有1条电泳带，经测序所述电泳带对应的扩增产物为274bp碱基片段;0908只有1条电泳带，经测序所述电泳带对应的扩增产物为233bp碱基片段;杂交品种有2条电泳带，经测序所述电泳带对应的扩增产物为274bp和233bp碱基片段。图1结果显示，新设计的引物扩增效果好，电泳带型清晰无杂带，引物可用于2种基因型的鉴别。

2.2 扩增产物与玉米茎腐病抗性性状的相关性 以高抗茎腐病材料1145和不抗茎腐病材料0908作亲本，两者杂交后自交的420个F2 代材料作为试验对象。PCR扩增产物用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，银染法染色并观察拍照记录，其中纯合274bp有103株，纯合233bp有97株，杂合带型有220株。同时，对这420株材料进行接种鉴定。由表1可知，供试玉米样本中存在纯合274bp有103株，其中101株表现为抗病，有2株感病;而不带有274bp片段的97个材料中92株感病，有5株抗病;杂合的220株，216株表现为抗病，4株感病;两者的一致性达到97.0%。因此，新设计的引物ZmCCT-2016是与茎腐病抗性性状相关位点相紧密连锁的分子标记，完全可用于玉米分子标记辅助育种。

3 讨论与结论

由于抗性品种的缺乏与耕作制度的变化（秸秆还田、保护性耕作等），茎腐病等土传性病害已成为我国玉米生产的主要病害之一[8]。随着种植方式的改变以及缺少抗菌谱广的抗性稳定品种，茎腐病危害逐年加重，已成为继大斑病、小斑病和丝黑穗病后我国玉米生产上又一重要病害[9]。分子标记辅助选择育种以其准确、快速，且不受环境影响等优点，已经广泛应用于作物育种实践中[10-11]。在玉米茎腐病抗性分子育种方面，已经成功选育出多个优良抗病新品系或新材料[12-13]。玉米茎腐病抗性是典型的质量数量性状，容易受环境影响，常规育种中的表型选择往往不准确，育种效率低。分子标记辅助育种是通过标记基因型分析和选择代替表型选择，选择准确性和育种效率大大提高[14]。

本研究筛选获得的分子标记，在F1群体中的抗病表型选择效率达97.0%;设计的分子标记位于茎腐病抗性基因ZmCCT的基因内部，与玉米茎腐病抗性基因ZmCCT紧密连锁;与非基因内部标记相比，新设计的InDel分子标记不会与基因功能出现分离，可以更有效地提高育种效率。

本研究设计的分子标记可以很好地扩增经过简单处理所得到提取的基因组，克服了现有技术中与该基因紧密连锁的其他分子标记需要依靠CTAB等较为烦琐的方法提取基因组的问题，更加简便实用，进一步提高了育种效率。

参考文献

[1]郭成，王宝宝，杨洋，等.玉米茎腐病研究进展[J].植物遗传资源学，2019（5）：1118-1128.

[2]段灿星，王晓鸣，武小菲，等.玉米种质和新品种对腐霉茎腐病和镰孢穗腐病的抗性分析[J].植物遗传资源学报，2015，16（5）：948-955.

[3]李莉，邢跃先，赵贤容，等.利用分子标记辅助选择技术提高玉米对丝黑穗病的抗性[J].植物保护学报，2012，04：303-307.

[4]Yang Q.，Yin G.M.，Guo Y.L.，et al.A major QTL for resistance to Gibberella stalk rot in maize[J].theor Appl Genet.，2010，121：673-687.

[5]Qing Yang，Zhi Li，et al.CACtA-like transposable element in ZmCCT attenuated photoperiod sensitivity and accelerated the postdomestication spread of maize[J].PNAS 2013，10.

[6]石明亮，黄小兰，陆虎华，等.玉米抗茎腐病研究进展及其鉴定与育种方法探讨[J].江苏农业科学，2017，45（4）：1-4.

[7]付求来，吴洁，朱先飞，等.不同碱煮时间对玉米快速提取DNA效果的影响[J].安徽农学通报，2019，25（12）：22-24.

[8]王晓鸣，晋齐鸣，石洁，等.玉米病害发生现状与推广品种抗性对未来病害发展的影响[J].植物病理学报，2006，36（1）：1-11.

[9]关淑艳，费建博，刘智博，等.分子标记辅助选择（MAS）在玉米抗逆育种中的应用[J].吉林农业大学学报2018，40（4）：399-407.

[10]宋伟，王凤格，易红梅，等.功能标记及在品种鉴定和辅助育种中的应用前景[J].分子植物育种，2009（3）：612-618.

[11]谭华，邹成林，郑德波，等.分子标记辅助选择抗南方玉米锈病材料[J].广东农业.2016，（7）.6-10.doi：10.16768/j.issn.1004-874X.2016.07.002.

[12]李少博，宋伟，王风格，等.分子标记辅助玉米自交系京24抗南方锈病的改良[J].分子植物育种，2012，10（4）：440-445.

[13]余辉，宋伟，赵久然，等.分子标记辅助选择育成的玉米自交系京24单抗丝黑穗病和茎腐病改良材料性状分析[J].分子植物育种官方网站，2014，12（1）：56-61.

[14]O，Boyle P D，James D，Kelly J D，et a1.Use of marker assisted selection to breed for resistance to common bacteriaI blight in common bean[J].Am soc Hortic sci，2007，132（3）：381-386.

（責编：张宏民）