王伟，何梦婷，许洁，张洁

苏州大学医学部公共卫生学院卫生毒理学教研室，江苏 苏州 215123

环境内分泌干扰物双酚A（bisphenol A，BPA）被广泛应用于制造多种生活日用品，包括罐头食品包装、婴儿奶瓶、医疗器械等。据统计，每年约有超过100 t BPA 制品释放到环境中，它们可通过直接接触，迁移至食物或饮品中，或扩散到水源或空气中，最终对生物体和生态环境造成破坏［1-2］。一项对普通美国居民的调查发现，他们尿液中BPA检出率高达93%［3］，而我国一般人群中BPA的暴露情况也十分普遍［4］。需要注意的是，BPA可以穿过胎盘屏障［5］，75%的母乳以及93%的新生儿尿液中也能检测到BPA［6］。因此，BPA 暴露（尤其是生命早期暴露）对于人类健康的影响不容忽视。研究发现妊娠期小鼠BPA暴露能增加子代小鼠成年后尤其是雌鼠的焦虑水平，并且减少小鼠成年后的探索行为及增加抑郁行为［7］。围产期低剂量BPA暴露能改变子代大鼠的大脑神经发育［8-9］。BPA处理斑马鱼胚胎后通过介导氧化应激和DNA 修复障碍导致斑马鱼胚胎发育毒性，出现运动行为异常等变化［10-11］。Kim 等［12］发现，斑马鱼暴露于BPA 后出现血清素能、多巴胺能、胆碱能和γ-氨基丁酸能等神经递质的高积累和随之而来的失调，从而导致斑马鱼的运动行为异常。除此之外，BPA 暴露也会引起斑马鱼甲状腺功能紊乱，从而导致胚胎发育异常［13-15］。多个出生队列研究显示孕期BPA 暴露与儿童的行为异常［16］及神经发育［17］相关。因此，阐明BPA早期暴露所致发育毒性的机制显得尤为重要。

芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AhR）是碱性螺旋-环-螺旋超家族中一类配体依赖性的转录激活因子，可以被包括某些多环芳香烃在内的多种环境化学物质激活［18］，进入细胞核与AhR核异位蛋白形成异二聚体，与下游调控基因的二噁英反应元件相结合，诱导Ⅰ相和Ⅱ相外源化学物代谢酶的表达，参与多种毒性反应。最近研究表明，三氯乙烯可以通过激活AhR，诱导细胞凋亡和氧化应激，进而导致斑马鱼的发育毒性［19］。Nakamura 等［20］研究发现，BPA 可以通过激活AhR和雌激素受体，从而诱导nrf2相关药物代谢酶的异常。Meng等［21］发现，围产期小鼠暴露于BPA后，可能通过激活TLR4/NF-κB和AhR通路引起炎症反应，从而降低雄性后代的精子生成能力和提高精子畸形率。那么，AhR是否可以介导BPA所致胚胎发育毒性？

斑马鱼因其生殖能力强，生长周期短，身体透明易观察等特点，逐渐成为毒理学研究的理想动物模型。本研究以斑马鱼作为模式动物，运用AhR 抑制剂CH223191（CH），通过观察斑马鱼幼鱼运动能力、死亡率、畸形率、孵化率、心脏毒性以及相关基因表达来探讨AhR在BPA所致发育毒性中的作用。

1 对象与方法

1.1 实验动物与试剂

实验用AB系野生型斑马鱼鱼卵（木芮生物科技有限公司，中国）。BPA、AhR 抑制剂CH223191（CH）（Sigma-Aldrich 公司，美国），二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（国药集团化学试剂有限公司，中国）。

1.2 主要仪器

体式显微镜（Olympus公司，日本），Zebrabox斑马鱼行为追踪分析仪（ViewPoint公司，法国），NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher 公司，美国），荧光定量PCR 仪（ABI公司，美国）。

1.3 实验方法

1.3.1 斑马鱼胚胎染毒实验根据实验室前期BPA 半数致死浓度的实验结果以及选择合适的死亡率和畸形率以便后续实验的进行，故选择1/2 LC50，即25 µmol·L-1BPA［10］。用DMSO 配 制1、5、25 µmol·L-1的BPA 工作液以及0.5 µmol·L-1的CH 工作液，用锡纸包好后-20℃冰箱避光保存备用。将受精后2 h（2 hours post-fertilization，2 hpf）大小均一的健康斑马鱼受精卵随机放入6 孔板中，每孔放置30 只鱼卵。每孔的液体总体积为3 mL，按照1 000：1 的比例将BPA 和CH 加入6 孔板中。分组情况为DMSO 对照组，CH 对照组，1、5、25 µmol·L-1BPA 染毒组，以及1 µmol·L-1BPA+CH、5 µmol·L-1BPA+CH、25 µmol·L-1BPA+CH干预组，同步设置3 个平行组。将6 孔板置于标准培养环境中，保持28.5℃恒温，14 h ：10 h 光-暗周期。每天更换培养液，直至96 hpf。每天定时观察，及时挑除死鱼，并记录死亡数。在72 hpf 记录斑马鱼的孵化数，在96 hpf 时记录斑马鱼的畸形数、死亡数、心率，以及镜下测量斑马鱼的体长。本实验中所有动物程序均已通过苏州大学伦理委员会动物护理机构的审查及批准（无编号）。

1.3.2 幼鱼行为运动能力测试在96 hpf时，将观察后的幼鱼用卵水清洗两次，然后全部更换为卵水继续培养至120 hpf。分别从8组中随机取12条无畸形的幼鱼置于96 孔板中，每孔1 条，加入200 µL 卵水，保证幼鱼可以自由游动。将96孔板放置于Zebrabox斑马鱼行为追踪分析仪中，设置仪器每20 min 照明与20 min 黑暗交替出现，重复140 min，开始记录前适应20 min。记录120 min 内幼鱼的游动距离。

1.3.3 引物设计及合成本研究所用引物均根据相关序列用软件Primer5 设计，并通过Blast（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）检验其保守性。检测基因包括心脏发育关键基因（nkx2.5、sox9b）、神经发育关键基因（elavl3、gfap、mbp、syn2a）、氧化应激相关基因（nrf2、sod1/2、ho1、nqo1），引物序列见表1。

1.3.4 斑马鱼胚胎总RNA提取及基因检测每个组收取≥20 个胚胎，使用Trizol 法提取总RNA。逆转录试剂盒逆转录合成cDNA 后，向cDNA 中加入SYBR green以及正向、反向引物进行实时定量PCR 实验。结果采用2-ΔΔCt分析目的基因表达的相对差异。正常状态下斑马鱼在72 hpf 时完成孵化，此时心脏发育已趋完善。96hpf时斑马鱼的整体发育已基本完成，并且96 hpf为暴露终点，因此主要检测该点的发育指标和基因表达。

表 1 本研究中荧光定量PCR引物序列Table 1 The sequence of qPCR primers in this study

1.4 统计学分析

死亡率、畸形率、孵化率、体长以及运动能力测试的实验数据通过Office 2016 Excel 处理，计量结果以±s表示。采用SPSS 20.0 进行单因素方差分析，根据方差齐性结果，如果方差齐，两两比较采用LSD-t检验；如果方差不齐，两两比较则采用Dunnet-t’检验。检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 BPA和CH暴露对斑马鱼胚胎发育的影响

72 hpf 时，与DMSO对照组相比，25 µmol·L-1BPA染毒组和25 µmol·L-1BPA+CH组斑马鱼孵化率分别下降33.6%和29.4%（P<0.05），且该CH 组与染毒组差异无统计学意义（P> 0.05）（图1A）。96 hpf 时，与DMSO 对照组相比，25 µmol·L-1BPA 组和25 µmol·L-1BPA+CH 组斑马鱼的心率分别下降23.6%和18.7%（P< 0.001），但25 µmol·L-1BPA+CH组心率高于25 µmol·L-1BPA组（P< 0.01）（图1B）。96 hpf 时，5、25 µmol·L-1BPA 组及25 µmol·L-1BPA+CH 组斑马鱼胚胎的死亡率较DMSO 对照组分别升 高10.3%、13.8%和11.1%（P< 0.05），且25 µmol·L-1BPA+CH组与25 µmol·L-1BPA染毒组差异无统计学意义（P> 0.05）（图1C）。96 hpf 时，25 µmol·L-1BPA 染毒组与25 µmol·L-1BPA+CH组斑马鱼的畸形率较DMSO 对照组分别升高12.0%和5.8%（P< 0.01），但25 µmol·L-1BPA+CH组畸形率低于25 µmol·L-1BPA染毒组（P< 0.01）（图1D）。与DMSO 对照组相比，斑马鱼胚胎的体长在5、25 µmol·L-1BPA 染毒组分别缩短3.6%和4.6%（P< 0.05）；而BPA+CH 组的体长大于相应的BPA 染毒组（P< 0.05），且与DMSO 对照组相比差异无统计学意义（P> 0.05）（图1E）。120 hpf 时行为检测发现，5、25 µmol·L-1BPA 染毒组斑马鱼的运动距离较对照组分别降低34.7%和50.4%，25 µmol·L-1BPA+CH 组运动距离高于25 µmol·L-1BPA 组（P< 0.05），该CH 组与DMSO对照组相比差异无统计学意义（P> 0.05）（图1F）。

图1 BPA和CH暴露对斑马鱼胚胎发育的影响（±s，n=3）Figure 1 The effects of BPA and CH exposure on zebrafish embryo development (±s, n=3)

2.2 BPA 和CH 暴露对斑马鱼胚胎AhR 信号通路相关基因表达的影响

如图2所示，在BPA暴露96 hpf后，与DMSO对照组相比，AhR受体基因ahr2的表达在各BPA染毒组及25 µmol·L-1BPA+CH组均上调，各CH组的表达均低于相应BPA 染毒组（P< 0.01），其中1、5 µmol·L-1BPA+CH 组与DMSO对照组相比差异无统计学意义（P> 0.05）。下游代谢酶CYP基因cyp1a1在各染毒组也均上调，各CH组的表达均低于相应BPA 染毒组（P< 0.05），其中1、25 µmol·L-1BPA+CH组与DMSO组相比差异无统计学意义（P> 0.05）。cyp1b1在5、25 µmol·L-1BPA染毒组及5 µmol·L-1BPA+CH组表达上调，25 µmol·L-1BPA+CH组的表达低于25 µmol·L-1BPA染毒组（P< 0.05），且该CH组与DMSO 对照组相比差异无统计学意义（P> 0.05）。

图2 BPA 和CH暴露对斑马鱼胚胎AhR信号通路相关基因表达的影响（±s，n=3）Figure 2 The effects of BPA and CH exposure on the expressions of genes related to AhR signaling pathway in zebrafish embryos (±s, n=3)

2.3 BPA和CH暴露对斑马鱼胚胎心脏发育相关基因表达的影响

如图3 所示，在BPA 暴露96 hpf 后，与DMSO 对照组相比，nkx2.5基因表达量在25 µmol·L-1BPA 染毒组 下 调39.7%，25 µmol·L-1BPA+CH 组的表达高于 相应染毒组（P< 0.05），且该CH 组与DMSO 对照组差异无统计学意义（P> 0.05）。sox9b基因表达量则在5、25 µmol·L-1BPA 染毒组及25 µmol·L-1BPA+CH 组分别下调14.4%、51.2%和20.7%（P< 0.05），且5、25 µmol·L-1BPA+CH 组的表达均高于相应染毒组（P< 0.05），而其中5 µmol·L-1BPA+CH 组与DMSO 对照组相比无统计学意义（P> 0.05）。

图3 BPA和CH暴露对斑马鱼胚胎心脏发育相关基因表达的影响（±s，n=3）Figure 3 The effects of BPA and CH exposure on the expressions of genes related to zebrafish cardiac development (±s, n=3)

2.4 BPA和CH暴露对斑马鱼胚胎神经发育相关基因表达的影响

如图4所示在BPA 暴露96 hpf 后，elavl3的基因表达在25 µmol·L-1BPA 染毒组下调53.1%，且相应CH 组的表达高于染毒组和DMSO 对照组（P< 0.001）。gfap和mbp基因 表 达在5、25 µmol·L-1BPA 染毒组较DMSO 对照组均出现下调，并且mbp在1 µmol·L-1BPA染毒组也出现下调，相应CH 组的表达均高于染毒组（P< 0.05），且与DMSO 对照组相比差异无统计学意义（P> 0.05）。syn2a基因表达在5、25 µmol·L-1BPA 染毒组均下调，25 µmol·L-1BPA+CH组基因表达高于相应染毒组（P< 0.05），且与DMSO对照组组相比差异无统计学意义（P> 0.05）。

图5 BPA 和CH 暴露对斑马鱼胚胎氧化应激相关基因表达的影响（±s，n=3）Figure 5 The effects of BPA and CH exposure on the expressions of genes related to zebrafish reactive oxygen species (±s, n=3)

图4 BPA和CH 暴露对斑马鱼胚胎神经发育相关基因表达的影响（±s，n=3）Figure 4 The effects of BPA and CH exposure on the expressions of genes related to zebrafish neurodevelopment (±s, n=3)

2.5 BPA和CH暴露对斑马鱼胚胎氧化应激相关基因表达的影响

如图5 所示，在BPA 暴露96 hpf 后，nrf2基因表达在5、25 µmol·L-1BPA 染毒组较DMSO 对照组分别上调20.9%和40.9%，25 µmol·L-1BPA+CH 组基因表达低于相应染毒组（P< 0.01），且与DMSO 组无统计学差异（P> 0.05）。sod1和sod2基因表达在5、25 µmol·L-1BPA染毒组均出现上调，其中sod2基因表达在1 µmol·L-1BPA 染毒组也出现上调（P< 0.05）；且5、25 µmol·L-1BPA+CH 组的sod1和sod2基因表达均低于各自BPA 染毒组（P< 0.05），并与DMSO 对照组相比差异无统计学意义（P> 0.05）。ho1和nqo1基因在5、25 µmol·L-1BPA组出现过表达（P< 0.05）；ho1在25 µmol·L-1BPA+CH组表达低于相应BPA 组，且与DMSO 对照组相比差异统计学意义（P> 0.05）；nqo1在5、25 µmol·L-1BPA+CH组表达均低于各自BPA 染毒组（P< 0.05），并与DMSO对照组相比差异无统计学意义（P> 0.05）。

3 讨论

作为一种内分泌干扰物，BPA在低浓度暴露时会干扰动物正常的内分泌功能，导致其生长发育异常［22］。本研究发现BPA 胚胎期暴露可导致斑马鱼的发育毒性，表现为死亡率和畸形率增加，孵化延迟，体长和心率下降，运动能力下降。用CH 干预后，心率和畸形率都较相应BPA 染毒组有所改善，并且体长和运动距离都恢复到了正常水平，表明AhR 信号通路的激活参与了BPA 所致斑马鱼胚胎的发育毒性。目前，关于BPA 毒作用的机制主要包括影响内分泌功能、雌激素受体介导的通路、拮抗雄激素受体介导的通路、组织内的酶等。

AhR 在无脊椎动物中仅具有生理功能，而在脊椎动物中能够结合二噁英类物质。哺乳动物仅有ahr1，而斑马鱼中有两个AhR 基因，且ahr2是主要的效应基因。研究表明AhR 可以通过上调代谢酶细胞色素酶P4501a1 和细胞色素酶P4501b1 来诱导活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生［23-24］，本研究发现BPA 暴露后ahr2以及下游代谢酶基因cyp1a1和cyp1b1均上调，而CH可使其恢复正常。上述结果表明BPA 暴露后，会引起AhR 通路的活化，这与Nakamura等［20］研究结果一致。

Wnt/β-catenin 通路在心脏发育中起着至关重要的作用［25］，β-catenin 的靶基因nkx2.5和sox9b是心脏发育的关键转录因子。研究表明，nkx2.5基因突变后会导致斑马鱼心脏畸形的发生［26］，而sox9b的缺失会导致斑马鱼心脏畸形，如心包水肿和心脏肿大［27］。与Huang 等［28］研究结果一致，本研究中，在BPA 暴露后斑马鱼心脏出现发育异常并且nkx2.5和sox9b的基因表达出现下调；在用CH 干预后，nkx2.5和sox9b的下调均得到了较好的逆转。在斑马鱼早期发育过程中，光暗交替刺激下的自由运动距离下降表明BPA引起斑马鱼脊柱运动神经元、肌肉或神经肌肉接头潜在结构或功能问题。神经系统特异性RNA 结合蛋白elavl3 是斑马鱼早期神经元的标志基因，是神经元分化和维持中重要的elavl 样基因家族成员之一［29］。作为中间丝结构蛋白家族成员的gfap 在分化胶质细胞方面有很高的表达［30］，其在中枢神经系统的放射状胶质细胞和星形胶质细胞中有高表达。研究发现，当斑马鱼胚胎暴露于磷酸三苯酯后，elavl3基因表达水平下降，使得斑马鱼胚胎出现神经发育毒性［31］。当大鼠在产前和产后早期暴露于铅时，由于神经发育受损，导致gfap表达下降。与此相同的是，在某些神经发育阶段暴露于铅的斑马鱼表现出gfap表达缺乏［32］。髓鞘碱性蛋白MBP则是髓鞘形成的生物标志物，而突触蛋白SYN2A 是一种神经磷蛋白质，在突触形成和神经递质释放过程中发挥重要作用［33］。GU 等［34］发现斑马鱼胚胎早期暴露于双酚S 后行为异常，mbp和syn2a基因表达下调，进而导致斑马鱼胚胎的神经发育紊乱。FU等［35］也发现斑马鱼暴露于BPA 后mbp和syn2a的基因和蛋白表达下调，胚胎出现神经发育毒性，进而导致运动能力的下降。本研究的结果与上述研究结果一致，当斑马鱼胚胎暴露于BPA后出现运动能力的下降，基因检测发现神经发育相关基因elavl3、gfap、mbp和syn2a均出现不同程度的下调。使用CH 进行干预后，这些基因的表达基本回到正常水平，并且运动能力也回到正常水平。

氧化应激被认为是肝脏、心血管和神经系统等靶器官的药物诱发毒性机制之一［36］。最近研究表明，AhR 的激活可能通过上调CYP 代谢酶的表达和释放过氧化物/过氧化氢来引起ROS 的产生［37-38］。另外，CH 可以减弱颗粒物和苯并［a］芘引起的ROS 产量增加［39-40］。转录因子核因子红细胞2相关因子被广泛认为是细胞抗氧化应激的关键因素［41］，并通过多种途径调节抗氧化防御系统，从而影响ROS的稳态［42］。本研究结果显示BPA 暴露后，nrf2基因的表达出现上调。Nrf2下游抗氧化相关基因（sod1、sod2、ho1、nqo1）的表达也出现了上调，表明nrf2通路被激活，CH 的干预使得这些基因回到正常水平。Jin 等［19］发现用三氯乙烯处理斑马鱼后，通过AhR 通路介导了氧化应激，从而导致斑马鱼胚胎心脏发育毒性，并且使用CH 后可挽救该毒性作用。

以上结果表明，BPA可能通过激活AhR，然后使得cyp1a1和cyp1b1过表达增强ROS的产生，从而导致斑马鱼胚胎的发育毒性（见补充材料http: //www.jeom.org/article/cn/10.13213/j.cnki.jeom.2021.20505）。该研究中仍有一些不足：一是BPA 激活AhR 的机制还需要深入探讨；二是死亡率和孵化率并未受到CH 挽救以及有些毒性表型未能完全挽救，这可能是由于还有别的途径导致这些毒性作用，还需要进一步进行研究。