潘洁菁 贺博武 张婷婷 陈曦 姚嘉明 陈芝芸*

肝内胆汁淤积主要是因胆汁分泌过多或排泄障碍，致胆汁酸和有毒物质潴留，损伤肝细胞，形成胆汁淤积性肝病，严重可发展成肝纤维化、胆汁性肝硬化［1］。而胆小管胆汁形成是渗透性分泌过程，依靠渗透梯度使水分子进入胆管。而位于肝细胞内、基侧膜和胆管膜的水通道蛋白（AQPs）是关键。而大黄可护肝利胆，为治湿热黄疸的要药。本研究采用异硫氰酸-α-萘酯灌胃建立急性肝内胆汁淤积性肝损伤模型，观察大黄水浸液对急性肝内胆汁淤积性肝损伤大鼠肝脏水通道蛋白8（AQP8）表达的影响，并探讨其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠，SPF级，8周龄，体重190~210 g，由上海西普尔-必凯实验动物中心提供［动物许可证号：SCXK（沪）2013-0016］。

1.2 大黄水浸液制备 由生大黄100 g加10倍量沸水浸泡20 min后，制成0.6 g/ml浓度生大黄浸出液备用。

1.3 主要试剂 异硫氰酸-α-萘酯（1-Naphthyl isothiocyanate，ANIT）由美国ThermoFisherACROS ORGANICS公司提供。丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒（产品号：14127070201）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒（14126070201）、总胆红素（TBIL）试剂盒（14108170201）为德赛诊断系统（上海）有限公司产品，大鼠胰高糖素（Glucagon，GC）酶联免疫检测试剂盒（H183-1-1）由南京建成生物工程研究所有限公司提供。总RNA提取试剂盒（9767）为宝生物工程（大连）有限公司产品；Evo M-MLV反转录试剂预混液（AG11706）、SYBR Green pro Taq HS 预混gajfqPCR试剂盒（AG11701）为湖南艾科瑞生物工程有限公司产品。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计并合成：AQP8 Forward primer：5'-GGA CAC TTC AAC CCT GCT GT-3'，Reverse primer：5'-CTG GAC TCA CCA CCT TAG CC-3'，产物片段136 bp；β-actin Forward primer：5'- TGT TGC CCT AGA CTT CGA GCA-3'，Reverse primer：5'- CCA TAC CCA GGA AGG AAG GCT-3'，产物片段155 bp。AQP8山羊多克隆抗体（sc-14984）为美国Santa Cruz公司产品，辣根酶标记兔抗山羊IgG（H+L）（ZB-2306）、DBA显色试剂盒（ZLI-9019）为北京中杉金桥生物公司产品。

1.4 实验方法 大鼠随机分为正常组、模型组、大黄高剂量组和大黄低剂量组，每组8只，实验第1~4天大黄高、低剂量组分别灌服6.0 g/（kg·d）和3.0 g/（kg·d）大黄水浸液，第3天上午8~9时灌服4% ANIT 100 mg/kg 1次；模型组第1~4天按10 ml/（kg·d）灌服0.9% 氯化钠液，第3天上午8~9时灌服4%ANIT 100 mg/kg 1次；正常组第1~4天按10 ml/（kg·d）灌服0.9% NaCl，第3天灌服等容量麻油；所有大鼠自由饮水，喂养全价颗粒饲料，于灌服ANIT后48 h（实验第5天）空腹麻醉下腹腔静脉取血，分离血清，全自动生化仪检测AST、ALT、TBIL水平，酶联免疫检测血清胰高糖素水平；分离肝脏，部分提取肝组织总RNA，采用荧光定量PCR法检测肝组织AQP8mRNA表达，以β-actin为内参，相对表达量（2-△△Ct）表示目的基因AQP8 mRNA表达水平；部分以10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，采用免疫组化法检测肝组织AQP8蛋白表达，结果判定：AQP8蛋白表达定位于细胞浆中，光镜下呈棕黄色细颗粒状，根据AQP8阳性细胞的着色程度及着色范围进行半定量［2］。

1.5 统计学方法 采用SPSS 24.0统计软件。计量资料以（±s）表示，采用单因素方差分析，计数资料采用非参数秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大黄水浸液对急性肝内胆汁淤积性肝损伤大鼠肝功能及GC的影响 模型组大鼠血清ALT、AST和TBIL水平比正常组增高（P<0.01），大黄高、低剂量组大鼠血清ALT、AST水平及TBIL水平比模型组降低（P<0.05或P<0.01），模型组大鼠血清GC水平比正常组降低（P<0.01），大黄高、低剂量组大鼠血清GC水平比模型组增高（P<0.05或P<0.01）见表1。

表1 大黄水浸液对大鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL、GC水平的影响（±s）

表1 大黄水浸液对大鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL、GC水平的影响（±s）

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01，与模型组比较，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01

组别 ALT（IU/L） AST（IU/L） TBIL（IU/L） GC（ng/ml）正常组 46.09±7.99 154.89±17.72 1.89±0.79 653.34±69.67模型组 1322.47±261.27** 2177.96±575.23** 126.81±17.66** 473.23±57.62**大黄高剂量组 805.37±164.92**ΔΔ 1305.10±441.79**Δ 104.65±16.61**Δ 599.68±95.79ΔΔ大黄低剂量组 855.94±227.57**Δ 1432.19±280.89**Δ 113.58±18.90** 553.93±65.22*Δ

2.2 大黄水浸液对急性肝内胆汁淤积性肝损伤大鼠肝组织AQP8表达的影响 模型组大鼠肝组织AQP8mRNA和蛋白表达比正常组下降（P<0.01），应用大黄水浸液高、低剂量干预后，肝组织AQP8mRNA和蛋白表达增强（P<0.01，P<0.05），见图1-2。

图1 大黄水浸液对急性肝内胆汁淤积性肝损伤大鼠肝组织AQP8mRNA及蛋白表达影响

图2 大黄水浸液对急性肝内胆汁淤积肝损伤大鼠肝组织AQP8蛋白表达的影响（免疫组化×200）

3 讨论

肝内胆汁淤积性肝损伤属于中医“黄疸”范畴。临床治疗黄疸的中成药均含有大黄。张林利［3］等发现熟大黄使幼龄SD大鼠血清胆红素及肝酶显著降低。大黄素治疗急性淤胆型肝炎模型大鼠的临床研究证实有较好疗效［4］。现代药理学表明［5］大黄可解除胆管括约肌痉挛，增强十二指肠和胆管舒张，疏通胆管和微细胆小管内淤积的胆汁。

肝细胞和胆管细胞可摄取和分泌胆汁，通过依靠可溶性膜蛋白转运系统的协调及渗透梯度，完成胆汁分泌并形成胆汁流。胆汁中的活性盐通过胆盐输出泵进入胆小管内腔产生渗透梯度，使水分子进入胆管。而胆汁中>95%为水份，故水的转运是形成胆汁流的关键。AQPs［6］是一种具有高选择性和高效转运水分子的跨膜蛋白。故肝细胞胆汁的分泌是由胆汁溶质转运体（包括胆盐输出泵）和AQPs联合作用。

AQPs由一系列膜通道蛋白组成，其中AQP8蛋白主要位于肝细胞的胆小管膜区域，负责调控水分子的跨膜转运。研究发现［7］，大鼠肝细胞内是通过囊泡运输调节胆小管膜上AQP8的数量，从而调节渗透压介导小管膜水的转运和胆汁形成。水通道蛋白表达的下降可能导致胆汁生成异常。在脓毒症相关、雌激素诱导和肝外梗阻性胆汁郁积症的小鼠模型中，发现AQP8的表达下调使胆小管水通透性减弱，导致胆汁生成异常［8］。研究发现高血糖刺激可增加细胞内环磷酸腺苷（cAMP）水平［9］。胰高血糖素是升血糖激素，也是利胆激动剂，其主要由cAMP依赖的蛋白激酶A介导，在cAMP的刺激下细胞内AQP8重新分配，增加胆小管质膜上AQP8的数量，使细胞膜水通透性增加，便于水的转运和胆汁形成。而应用蛋白激酶A抑制剂可抑制胰高血糖素诱导的AQP8的再分布［10］。

本研究显示，大黄水浸液干预能降低ANIT灌胃引起的大鼠血清ALT、AST、TBIL水平升高，提示大黄水浸液可改善急性肝内胆汁淤积性肝损伤。同时，ANIT诱导的急性肝内胆汁淤积性肝损伤大鼠血清GC水平下降，肝组织AQP8表达下调，TBIL异常增高，肝细胞受损，提示ANIT可能通过降低大鼠胰高血糖的分泌和抑制AQP8的表达，造成胆汁分泌异常，肝组织受损。应用大黄水浸液干预后，大鼠血清GC水平较模型组增高，肝组织AQP8mRNA和蛋白表达上调，血清肝功能明显改善，提示大黄水浸液对急性肝内胆汁淤积性肝损伤大鼠胰高血糖素有激动作用并促进肝组织AQP8的活化，这可能是大黄防治急性肝内胆汁淤积性肝损伤的重要机制之一，其具体调节途径和机制还需进一步研究探讨。