刘 菲，徐晶晶，周 珺，韩 野

（苏州大学附属第一医院1.消化科；2.中心实验室；3.普外科，江苏 苏州 215006）

胃癌（gastric cancer, GC）是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率居第四位，死亡率居第三位，仅次于肺癌和肝癌[1]。尽管目前胃癌的诊断和治疗取得了重大进展，早期胃癌患者的生存率得到了明显提高，但进展期胃癌的预后仍不是很理想，其5 年生存率仍不足20%，远处转移仍然是胃癌患者最主要的致死原因[2]。目前胃癌的治疗方案还是以手术为主，辅以术后的放化疗，但其术后复发率高，放化疗效果不理想，生存率较低，尤其是晚期胃癌患者[3]。研究表明胃癌的发生发展是一个多因素的、多步骤的、复杂的过程，包括患者所身处的生活环境、饮食因素、遗传因素，相关基因突变包括癌基因的激活、抑癌基因的失活等，均参与了胃癌的发生发展，但其具体的分子机制仍不明确。因此，为了提高胃癌的早期诊断率并寻找新的更有效的治疗方案，进一步深入研究胃癌的发病机制刻不容缓。

MicroRNA（miRNA）是近年发现的一类在生物体内广泛表达的、长22～24 nt的、高度保守的非编码调节性小分子RNA。它们可以通过抑制其靶基因mRNA的翻译或直接将其降解，在转录后水平调控基因的表达，并可以进一步调控其靶基因参与的相关信号转导通路，参与调控哺乳动物多个器官的发育过程和人类疾病的发生[4-5]。一个miRNA可以调控多个基因的表达，而几个miRNA也可以调控某一个基因的表达，这说明miRNA及其靶分子能够形成庞大、错综复杂的生物调控网络。研究[6-7]表明，miRNA参与调控细胞内多种生物学过程，包括细胞周期、增殖和凋亡、分化以及代谢等，并在肿瘤的发生发展过程中发挥了重要作用。在胃癌中，已发现多种异常表达的miRNA，其参与了胃癌的发生、侵袭、转移等生物学过程，并通过调控各自不同的靶基因影响胃癌细胞的恶性生物学行为[8]。

miR-17-92也称为oncomiR-1，是最具代表性的发挥癌基因样作用的miRNA之一，位于人类基因组第13号染色体上C13orf25基因初级转录本的第3个内含子区，其初级转录物编码六种成熟的miRNA：miR-17，miR-18a，miR-19a，miR-19b-1，miR-20a和miR-92a-1[9-10]。已有研究发现，miR-17-92基因簇在多种肿瘤中高表达，并促进肿瘤的发生发展，发挥着类似于癌基因样的作用；也有少数研究[11]报道称miR-17-92基因簇能抑制肿瘤的进展，发挥着类似于抑癌基因样的作用。然而，目前对于miR-17-92基因簇在胃癌发生发展中的研究报道尚不多。

目前临床上对于胃癌的治疗效果仍不理想，其主要难题是胃癌易发生转移，其早期临床症状不典型，早期诊断率较低，发现的时候大多数已到中晚期，因此miRNA无论在胃癌的早期诊断还是术后检测方面均具有较为广阔的前景。尽管已有研究[12]表明多种miRNA都具有潜在胃癌生物学标志物的作用，但仍需进一步的探索和临床验证，同时还需建立一套标准化的体系以及miRNA大样本的数据库完善。本文通过研究miR-17-92基因簇在人胃癌组织中的表达水平，并分析其与胃癌患者临床病理资料的相关性，随后通过在胃癌细胞中过表达miR-17-92，验证其对胃癌细胞生长和侵袭能力的影响，对miR-17-92的生物学功能进行更加深入的研究，为胃癌的临床诊断、治疗及预后监测提供新的策略和理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器、试剂和抗体 流式细胞仪FASCalibur购自BD Biosciences公司；System Microscope IX7荧光倒置显微镜购自Olympus公司；NanoDrop1000购自Thremo公司；xCelligence细胞实时动态监测系统、E-Plate/CIM-Plate培养板、LightCycler 480荧光定量PCR仪和FuGENE HD均购自Roche公司；Odyssey荧光扫描成像系统购自Li-COR公司；RPMI-1640和胎牛血清购自Gibco公司；抗体AKT（#4691），p-AKT（Ser473，#4060），p-AKT（Thr308，#2965），ERK（#4695），pERK（#4370S），Integrin β1（#9699）购自Cell Signaling Technology公司；β-actin（AT0001）抗体购自CMCTAG公司；嘌呤霉素（J539-25MG）购自Amresco公司；逆转录试剂M-MLV（28025-013）和合成引物购自Invitrogen公司；SYBR Premix Ex Taq（RR420）购自TaKaRa公司；Matrigel（356234）购自BD Biosciences公司。

1.2 临床资料 收集我院普外科2018年9月—2019年12月接受胃癌根治术患者的手术切除癌组织及相应癌旁正常组织标本共计30 例，手术切除后立即将其放置于液氮罐中保存。所有患者术前均未接受任何放疗和化疗，并签署了相关知情同意书。临床标本的收集及使用获得了苏州大学附属第一医院伦理委员会的批准。

1.3 细胞培养 胃癌细胞株MGC-803为本实验室长期保存，培养于含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素及100 µg/mL链霉素的RPMI-1640完全培养基中，并在37 ℃，5% CO2及含饱和湿度的细胞培养箱中培养。Phoenix A包装细胞使用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的DMEM培养基进行培养。应用倒置显微镜观察细胞生长情况，2～3 d传代一次，均选用对数生长期细胞进行后续实验。

1.4 实时荧光定量PCR（qRT-PCR） Trizol裂解液一步法提取细胞总RNA，并用NanoDrop定量RNA浓度和质量。按照逆转录试剂说明，利用M-MLV将2µg RNA逆转录合成cDNA。qRT-PCR在LightCycler 480荧光定量PCR仪上进行，每个反应设3 个复孔，40 个循环。以U6作为内参，检测每个反应孔中荧光达到设定值时所经历的循环数（即Ct值），基因mRNA相对表达水平用2-△△Ct计算。引物序列用NCBI的PrimerBlast设计，具体引物序列见表1。

表1 qRT-PCR所用引物序列Tab.1 The primer sequences used in qRT-PCR analyses

1.5 建立稳定转染的miR-17-92过表达细胞株 在35 mm培养皿中接种Phoenix A包装细胞，使第2天细胞融合度达到70%～80%时进行转染。转染试剂为FuGENE HD，按照产品说明进行转染。使用包装载体pCL和MSCV-GFP-miR-17-92共同转染Phoenix A包装细胞，18 h后通过荧光显微镜观察转染效率，更换新鲜培养基，48 h后收集病毒上清，并用此病毒上清转染靶细胞MGC-803。同时使用包装载体pCL和空载体MSCV-GFP转染MGC-803细胞作为对照。利用嘌呤霉素（5 μg/mL）筛选，最终获得稳定转染的细胞株。

1.6 xCELLigence系统检测细胞生长及侵袭 利用xCelligence系统和RTCA 1.2软件进行细胞指数（cell index）的实时动态监测。“细胞指数”是由测得的电阻抗推算出的一个无量纲参数，它与黏附上去的细胞数量直接相关。当系统专用的培养板（E-plate或CIM-plate）中未加细胞时，各个培养孔中的“细胞指数”相同，为起始空白值，当加入细胞后，随着细胞的贴壁和增殖生长，由此产生的电阻抗信号产生变化，即细胞贴壁多，信号高，“细胞指数”数值大。实验按照仪器使用说明书进行，用E-plate培养板检测细胞生长，用CIM-plate培养板检测细胞侵袭。

1.7 Western blot检测蛋白表达 按照标准蛋白提取方法，使用RIPA裂解缓冲液提取细胞全蛋白。经10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，半干转到硝酸纤维膜上。用5%脱脂奶粉封闭1 h后，加入一抗，4 ℃孵育过夜。PBST洗膜后，加入荧光二抗，室温避光孵育45 min。最后用Odyssey荧光扫描成像系统进行成像检测。

1.8 明胶酶谱实验检测MMP活性 细胞常规培养24 h，当细胞融合度达70%～80%后，更换无胎牛血清培养基，继续培养24 h，收集培养上清液。取20µL上样于8%聚丙烯酰胺凝胶（含1%明胶），电泳后，取出凝胶，置于复性液中孵育1 h，然后置于消化液中37 ℃孵育40 h，孵育结束后经染色液染色1 h，再经脱色液脱色，终止液终止脱色。最后显示MMP-2、MMP-9为蓝色背景上的透亮带，干燥、封胶，拍照。

1.9 统计学处理 独立实验重复3 次，数值以均值±标准差（±s）表示，运用SPSS 19.0软件进行统计分析，不同实验组之间采用均数单因素方差分析或Student'st检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-17-92基因簇各亚单位在胃癌组织及癌旁正常组织中的表达差异 我们运用qRT-PCR法分别检测了miR-17-92基因簇的6个亚单位miR-17、miR-18、miR-19a、miR-19b、miR-20和miR-92在30 例胃癌组织及其对应的癌旁正常组织中的表达情况，如图1所示：与癌旁正常组织相比，miR-17-92基因簇的6个亚单位在胃癌组织中的表达均显著升高，且差异均具有统计学意义（P＜0.05）。

图1 qRT-PCR法检测miR-17-92基因簇各亚单位在胃癌及癌旁组织中的表达Fig.1 The expression pattern of each subunits of the miR-17-92 cluster in human gastric cancer tissues and the corresponding adjacent normal tissues were detected by qRT-PCR analyses

2.2 miR-17-92基因簇各亚单位的表达水平与胃癌患者临床病理资料的相关性分析 为了进一步探讨miR-17-92基因簇各亚单位的表达水平与胃癌患者临床病理资料的关系，我们对30 例胃癌患者的临床病理资料进行了亚组分析，其亚组分组指标包括年龄、性别、肿瘤大小、分化程度及TNM分期。如表2所示：miR-17的表达水平在不同年龄（P＝0.6708）、不同性别（P＝0.5938）、不同肿瘤大小（P＝0.7588）差异无统计学意义，而在不同分化程度（P＝0.0031）、不同TNM分期（P＝0.0020）差异具有统计学意义。miR-18的表达水平在不同年龄（P＝0.6372）、不同性别（P＝0.6238）、不同肿瘤大小（P＝0.3339）、不同分化程度（P＝0.1802）差异无统计学意义，而在不同TNM分期（P＝0.0020）差异具有统计学意义。miR-19a的表达水平在不同年龄（P＝0.7216）、不同性别（P＝0.9089）、不同分化程度（P＝0.2841）差异无统计学意义，而在不同肿瘤大小（P＝0.0002）、不同 TNM 分期（P＝0.0012）差异具有统计学意义。miR-19b的表达水平在不同年龄（P＝0.5986）、不同性别（P＝0.7826）、不同分化程度（P＝0.8125）差异无统计学意义，而在不同肿瘤大小（P＝0.0072）、不同TNM分期（P＝0.0002）差异具有统计学意义。miR-20的表达水平在不同年龄（P＝0.6519）、不同性别（P＝0.6056）、不同肿瘤大小（P＝0.6011）差异无统计学意义，而在不同分化程度（P＝0.0143）、不同 TNM 分期（P＝0.0023）差异具有统计学意义。miR-92的表达水平在不同年龄（P＝0.8661）、不同性别（P＝0.9336）、不同分化程度（P＝0.1888）差异无统计学意义，而在不同肿瘤大小（P＝0.0374）、不同TNM分期（P＝0.0035）差异具有统计学意义。

表2 miR-17-92的表达与胃癌患者临床病理资料的关系Tab.2 The relationship between the miR-17-92 cluster and clinicopathological features of gastric

2.3 构建稳定过表达miR-17-92基因簇的胃癌细胞株为了进一步验证miR-17-92在MGC-803胃癌细胞株中的生物学功能，我们构建了过表达miR-17-92的质粒并运用慢病毒上清将其转染入MGC-803细胞中，并用嘌呤霉素筛选出了单克隆细胞。在荧光显微镜下观察，我们发现MGC-803-control细胞及MGC-803-miR-17-92细胞均表达很强的绿荧光信号；用流式细胞仪检测其荧光纯度分别为95.88%及96.71%。用qRT-PCR法进一步检测了被筛选出来的单克隆细胞中miR-17-92的表达情况，我们发现MGC-803-miR-17-92细胞中miR-17-92家族各个成员的表达量均较MGC-803-control细胞显著上调，如图2所示，miR-17上调4倍，miR-18上调3倍，miR-19a上调6倍，miR-19b上调5倍，miR-20上调4倍，miR-92上调2倍，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。因此，我们成功构建了稳定过表达miR-17-92基因簇的MGC-803胃癌细胞株。

图2 qRT-PCR法检测MGC-803-control细胞和MGC-803-miR-17-92细胞中miR-17-92基因簇的表达Fig.2 The mRNA expression levels of the miR-17-92 cluster between the MGC-803-control cells and the MGC-803-miR-17-92 cells were detected by qRT-PCR

2.4 过表达miR-17-92对MGC-803细胞生长的影响 接种8 000 个细胞/孔在E-plate，通过xCELLigence系统实时动态监测细胞生长72 h。如图3A所示，在起始的10 h内，MGC-803-control细胞与MGC-803-miR-17-92细胞生长速度无显著差异，但从24 h开始两组细胞的生长曲线有了明显的差异，纵坐标细胞指数显示的数值提示MGC-803-miR-17-92细胞的生长速度明显快于MGC-803-control细胞，差异具有统计学意义（P＜0.05）。因此过表达miR-17-92加快了MGC-803细胞的生长。我们还检测了两组细胞中AKT信号通路的蛋白表达情况，如图3B所示，MGC-803-control和MGC-803-miR-17-92细胞的全蛋白提取液中总AKT表达水平相似，但过表达miR-17-92促进了AKT蛋白在苏氨酸308位点的磷酸化，而对丝氨酸473位点的磷酸化无明显影响。另外，我们还检测了两组细胞中细胞外信号调节激酶（ERK1/2）的蛋白表达，如图3C所示，两组之间差异无统计学意义，但MGC-803-miR-17-92细胞中磷酸化的细胞外信号调节激酶（p-ERK1/2）的蛋白表达显著高于MGC-803-control细胞。因此，过表达miR-17-92在不影响ERK1/2蛋白表达的情况下上调了MGC-803细胞中ERK1/2蛋白的磷酸化。

图3 过表达miR-17-92对MGC-803细胞生长的影响。A：xCELLigence系统监测MGC-803-control细胞和MGC-803-miR-17-92细胞72 h生长情况；B：Western blot法测定过表达miR-17-92对MGC-803细胞内AKT信号通路的影响（β-Actin为上样对照）；C：Western blot法测定过表达miR-17-92对MGC-803细胞内ERK1/2信号通路的影响（β-Actin为上样对照）。Fig.3 miR-17-92 overexpression affects cell growth of the MGC-803 cells. A: Cell growth of the MGC-803-control cells and the MGC-803-miR-17-92 cells were monitored by a real-time xCELLigence system; B: The protein expression levels of AKT signaling between the two established cell lines were measured by Western blot; C: The protein expression levels of ERK1/2 signaling between the two established cell lines were measured by Western blot.

2.5 过表达miR-17-92对MGC-803细胞侵袭的影响 接种50 000 个细胞/孔在CIM-plate，通过xCELLigence系统实时动态监测细胞侵袭24 h。如图4A所示，在起始的9 h内，MGC-803-control细胞与MGC-803-miR-17-92细胞的侵袭能力无显著差异。但从12 h开始两组细胞的生长曲线有了明显的差异，纵坐标细胞指数显示的数值提示MGC-803-miR-17-92细胞的侵袭能力明显强于MGC-803-control细胞，差异具有统计学意义（P＜0.05）。因此过表达miR-17-92显著增强了MGC-803细胞的侵袭能力。我们用Western blot法检测了两组细胞中Integrin β1的表达水平，发现MGC-803-miR-17-92细胞中Integrin β1的表达水平显著高于MGC-803-control细胞（图4B）。此外，我们还用明胶酶谱实验检测了两组细胞中MMP的活性，结果发现MMP-9在两组细胞中的活性均很低，而MMP-2在MGC-803-miR-17-92细胞中的活性显著高于MGC-803-control细胞（图4C）。

图4 过表达miR-17-92对MGC-803细胞侵袭能力的影响。A：xCELLigence系统监测MGC-803-control细胞和MGC-803-miR-17-92细胞24 h内的侵袭能力；B：Western blot法测定过表达miR-17-92对MGC-803细胞内Integrin β1蛋白表达的影响（β-Actin为上样对照）；C：明胶酶谱实验检测过表达miR-17-92对MGC-803细胞内MMPs活性的影响。Fig.4 miR-17-92 overexpression affects cell invasion ability of the MGC-803 cells. A: Cell invasion abilities of the MGC-803-control cells and the MGC-803-miR-17-92 cells were monitored by a real-time xCELLigence system; B: The protein expression levels of Integrin β1 between the two established cell lines were measured by Western blot; C: The activities of MMP-2 and MMP-9 between the two established cell lines were measured by gelatin zymography experiment.

3 讨论

在本研究中， 我们首先通过qRT-PCR法检测了30 例胃癌组织标本中miR-17-92基因簇各亚单位的表达情况，结果发现miR-17-92基因簇的6个亚单位（miR-17，miR-18，miR-19a，miR-19b，miR-20及miR-92）在胃癌组织中的表达量均显著高于其对应的癌旁正常组织，且均与胃癌患者的TNM分期呈正相关，其中miR-17、miR-20的表达水平还与胃癌患者的肿瘤分化程度呈正相关，miR-19a、miR-19b、miR-92的表达水平还与肿瘤大小呈正相关。我们的实验结果与一些已报道的文献结果相一致[13-15]，高度提示miR-17-92基因簇在胃癌发生发展中扮演着癌基因样的角色。

接下来，我们通过构建稳定过表达miR-17-92的MGC-803胃癌细胞株作为研究模型，来进一步验证miR-17-92对胃癌细胞生长和侵袭能力的影响，并探讨其潜在的分子机制。我们发现过表达miR-17-92能够显著加快MGC-803胃癌细胞的生长，其机制与AKT及ERK1/2信号通路的活化密切相关。各种细胞外的信号刺激都会诱发细胞内PI3K/AKT信号通路产生各种应答，以促进细胞存活、快速增殖和细胞生长。而PTEN作为PI3K/AKT信号传导通路上游的关键负调控因子，主要受到miR-17-92基因簇家族成员miR-19的靶向调控[16]。因此，过表达miR-17-92能够通过下调其靶基因PTEN的表达，进而活化PI3K/AKT信号通路。同样地，ERK1/2信号通路也参与细胞存活、增殖及凋亡抵抗[17]。有研究[18]表明，敲除miR-17能够显著抑制KATO-Ⅲ胃癌细胞的增殖能力，该过程与ERK1/2的磷酸化水平降低有关。在本研究中，我们发现在MGC-803胃癌细胞中过表达miR-17-92后细胞内AKT及ERK1/2总蛋白的表达水平并未改变，而AKT蛋白在Thr308位点的磷酸化水平及ERK1/2蛋白的磷酸化水平较对照组细胞显著升高。由此我们可以看出，过表达miR-17-92能够显著加快MGC-803胃癌细胞的生长，AKT和ERK1/2信号通路的活化在其中起着至关重要的作用。

此外，我们还发现过表达miR-17-92能够显著增强MGC-803胃癌细胞的侵袭能力。已有相关文献报道，miR-17-92基因簇在肿瘤的侵袭和转移中起着重要作用[19]，我们的实验结果与其报道相一致。过表达miR-17-92基因簇能够显著促进DU145前列腺癌细胞的体外迁移和侵袭能力[20]。miR-17可以通过靶向作用ETV1基因调控其表达进而促进黑色素瘤细胞的体外迁移能力[21]。miR-19a/b能够通过靶向作用c-Myc-MXD1拮抗剂而促进胃癌细胞的迁移和侵袭[22]。相反地，有文献报道称miR-17-92基因簇在胃癌中低表达，且其表达与转移呈负相关[23]。我们的前期研究表明，在MGC-803胃癌细胞中过表达miR-17-92能够导致NF-κB信号通路被激活，而MMP-2作为NF-κB信号通路的下游靶基因[24]，其表达活性较对照组细胞显著增强。MMP-2和MMP-9是基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMPs）家族成员，可以降解各种胞外基质蛋白，也可以处理多种生物活性分子，参与细胞增殖、肿瘤细胞迁移侵袭、细胞分化、血管生成、细胞凋亡和宿主防御等生物过程[25]。近年来，研究[26]表明miRNA在转录后水平参与MMPs调控，最终影响MMPs基因的翻译和表达。本研究发现过表达miR-17-92能够显著上调MMP-2的活性，进而增强MGC-803细胞的侵袭能力。

Integrin β1属于Integrins家族，由ITGB1基因编码。Integrins在细胞表明黏附和识别作用中起着重要作用，也参与胚胎发育、止血、组织修复、免疫应答和肿瘤细胞的转移扩散等其他重要的生物学功能，同时在肿瘤细胞的侵袭方面扮演着重要角色[27]。Han等[28]研究表明，在胃癌中Integrin β1作为miR-29c的调控靶点之一参与并增加肿瘤细胞的黏附、迁移及侵袭能力。Zhao和Xu等[29-30]还报道了Integrin β1的表达情况与胃癌患者的预后及复发密切相关。另有体内实验[31-32]证实，胃癌组织中Integrin β1的表达量与腹膜转移呈正相关，Integrin β1表达的沉默可以显著降低其腹膜转移的发生率。本研究发现过表达miR-17-92能够显著上调MGC-803细胞中Integrin β1蛋白的表达，由此可见Integrin β1蛋白表达上调可能是miR-17-92增强MGC-803细胞侵袭能力的潜在机制之一。

综上所述，本研究证实了miR-17-92基因簇在胃癌组织中表达量较癌旁正常组织显著升高，且与胃癌患者的肿瘤大小、分化程度及TNM分期呈正相关。过表达miR-17-92能够显著促进胃癌细胞的生长，该过程与AKT及ERK1/2信号通路的激活密切相关。过表达miR-17-92能够显著增强胃癌细胞的侵袭能力，其机制与Integrin β1表达上调及MMP-2活性增强有关。这些研究结果提示了miR-17-92基因簇在胃癌的发生发展过程中扮演着癌基因样的角色，可将其作为胃癌早期诊断的分子生物学标志物，并为探索胃癌分子靶向治疗的新靶点提供理论依据。